新冠肺炎实验室建立文件系列之2 新型冠状病毒核酸检测标准操作程序.docx
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新冠肺炎实验室建立文件系列之2新型冠状病毒核酸检测标准操作程序
02新型冠状病毒核酸检测标准操作程序
1目的
规范PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序，保证实验结果的正确可靠。
2范围
适合于检验科发热门诊。
3职责
3.1检验人员负责按照本检测细则对被检样本进行检测；
3.2复核人员负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；
3.3专业组负责人负责对专业组综合管理和检测报告的审核。
4程序、内容和要求
任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。
本程序中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsidprotein，N）。
在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：
同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性PCR检测结果均为阳性。
阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：
样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。
4.1样本采集（推荐鼻/咽拭子）
4.1.1咽拭子（使用透景样本保存液）
用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入样本保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。
4.1.2鼻拭子（使用透景样本保存液）
将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一样本保存液的采样管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。
4.1.3鼻咽拭子样本（未使用透景的保存液）：
在有鼻咽拭子的收集管中加入1ml生理盐水，振荡混匀后将全部液体倒入1.5ml灭菌离心管中作为样本使用。
4.2标本保存
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。
应设立专库或专柜单独保存标本，标本运送期间应避免反复冻融。
4.3样本灭活
为了减少感染样本对人和环境的潜在危害，推荐样本检测前进行灭活处理：
先56℃干/水浴60min，静置10min至室温（避免气溶胶），然后进行处理。
4.4核酸提取
4.4.1Smart32核酸提取仪提取程序
4.4.1.1操作前准备
a）将处理好的样本以及试剂添加在96孔提取板内。
b）运行实验程序前，检查96孔提取板及磁棒套是否正确放置（注意：
放置磁棒套时，将磁棒套顺着卡槽推入到尽头）。
4.4.1.2操作
a）确保仪器的电源线与合规格的电源插座连接好后，打开仪器背面右下的主电源开关。
b）仪器上电开机后，进行自检。
如下图所示：
c）待完成自检后系统进入主菜单操作界面。
如下图所示：
d）主界面主要包括仪器功能选项及快捷实验运行方式；通过点击所要运行的程序快捷方式的图标及“程序列表”，可进入实验运行界面或实验程序列表界面。
如下图所示：
e）点击
和
按键查看完整程序运行步骤；
f）点击
按键后，实验程序将开始运行。
注意：
执行前请务必确认：
注意：
96孔提取板是否正确放置；
注意：
磁棒套是否推入到位；
注意：
仪器门是否关好。
g）在程序运行过程中，当前运行步骤，该行信息变为深色；在程序运行过程中，仪器门不能打开。
h）实验结束后，仪器弹窗实验结束。
i）在主界面左边框主选项中，点击“开门”选项，当听到“嗒”一声时，手动拉开仪器门。
j）仪器的清理：
卸载仪器上的试剂、耗材、实验产生的废物。
k）点击
进行紫外灯照射消毒。
4.4.1.3Smart32核酸提取仪日常维护
a）指导原则：
当Smart32核酸提取仪在标准的实验室环境下最佳的工作条件工作时，仪器不需要定期的维护，但是，应由经过厂商指导的实验室技术人员进行定期的清洁与自测诊断。
b）清洁：
定期或维修搬运前应断电并清洁仪器的外表面，以防止任何可能干扰仪器功能的灰尘粒子。
用微湿的软布进行Smart32仪器的清洁，用10%的家用漂白剂及去离子水就可以安全地净化仪器。
注意，清洁仪器的外表面均需用微湿的软布。
注意：
在清洗或执行任何本节所提到的维护前，务必关闭Smart32仪器及相关设备的电源；清洁仪器时请小心，确保无液体流入仪器中。
4.4.2核酸提取或纯化试剂标准操作程序
4.4.2.1原理
磁珠结合液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使核酸解离出来；在其存在下，释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上；随后通过磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2的作用下，将蛋白质，无机盐离子和许多有机杂质去除。
然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。
4.4.2.2标本要求
a）标本类型：
血清、血浆、宫颈脱落细胞、咽拭子、鼻咽分泌物等。
b）标本采集：
血清/血浆—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25ºC）放置30～60分钟，血标本可自发完全凝集析出血清，
或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
血浆—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5～10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。
咽拭子、鼻咽分泌物等标本的处理请参照卫生部发布的针对该检测物的监测方案和检测技术方案。
宫颈脱落细胞标本的采集需医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，瞬时针旋转4-6周以获取足量的上皮细胞，然后取宫颈刷置于盛有2ML生理盐水的无菌小试管中。
c）标本储存和运输：
新鲜血清2～8℃贮存时间不超过12小时；也可保存-20度待测，保存期为15天。
标本运送应采用0℃冰壶。
并于12小时送达。
d）标本拒收状态：
细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
4.4.2.3试剂及仪器设备
a）试剂名称：
核酸提取或纯化试剂。
b）试剂生产厂家：
中山大学达安基因股份有限公司
c）包装规格：
32人份/盒
d）试剂盒组成：
预分装96孔深孔板2块，蛋白酶K1瓶。
e）贮存条件和有效期：
室温保存；有效期12个月。
f）Smart32核酸提取仪。
4.4.2.4操作
a）试剂准备（在试剂准备区操作），从试剂盒中取出预分装96孔深孔板，颠倒混匀数次后，使用96孔板离心机500rpm离心1分钟，使试剂和磁珠均甩到孔板底部，使用时小心撕去封膜，防止液体溅出。
b）标本制备及加样（在标本制备区操作）。
c）标本处理：
将待测样本与阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品进行同步处理。
在96深孔板的第1、7列（A-H排）中按顺序加入200ul的样本、20ul蛋白酶K。
使用smart32型核酸提取仪进行核酸提取（操作见smart32核酸提取仪标准操作程序）
d）程序设置（smart32型核酸提取仪程序编辑）
步骤
孔位
名称
等待时间min
混合时间min
吸磁次数
混合速度
容积ul
温度状态
温度℃
1
2
磁珠
0
1
3
中
400
关
0
2
1
磁珠结合液
0
15
3
快
750
第一孔
70
3
3
磁珠洗涤液1
0
2
2
快
600
第6孔
50
4
4
磁珠洗涤液2
0
0
1
中
600
第6孔
70
5
6
洗脱液
0
5
3
中
100
第6孔
70
6
3
丢弃磁珠
0
1
0
中
600
关
0
e）程序运行结束后，第6列和第12列中的液体即为核酸溶液，建议立即使用，如需保存请将核酸转移至灭菌的离心管中，置于-20℃。
4.4.2.5注意事项
a）实验前请仔细阅读本试剂说明书。
b）不同型号的核酸提取仪由于硬件的关系可能需设置不同的提取程序，详细参数可以咨询试剂厂家。
c）标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。
d）实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。
e）所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：
卫生部微生物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例
4.4.3样本释放剂标准操作程序
4.4.3.1预期用途
用于待测样本的预处理，使样本中的待测物从与其他物质结合的状态中释放出来。
以便于使用体外诊断试剂或仪器对待测物进行检测。
本产品主要由核酸释放剂组成，用于病毒样本的采集保存、病毒灭活裂解、核酸的释放。
采集拭子样本，放入含有样本核酸释放保存液中，样本核酸DNA或RNA即可释放，直接作为PCR模板进行扩增，无需加热或其他核酸提取操作，用于病原体快速检验或样本筛查的样本前处理。
4.4.3.2原理
此产品的核酸释放保存液，含有有机溶剂和去污剂成分，可对细胞或病毒的蛋白质结构变性，灭活病毒或其他微生物。
通过震荡和浸泡，快速从样本中释放核酸，另本产品含有的核酸保护剂成分，对DNA或RNA具有保护作用，在等待检测或运输保存过程中，防止样本中病毒核酸降解。
本产品成分对病毒具有灭活作用，但对于重大传染性疾病的生物样本，还应严格按照相关指南进行灭活，并严格在生物安全柜进行操作。
4.4.3.3适用范围：
拭子类样本（咽/鼻/眼结膜）
4.4.3.4使用方法
a）保存方法：
将采样后的离体病毒类拭子高出采样管的部分折断，含有样本的拭子头浸没于含有样本释放剂的采样管里，旋紧管盖。
如果不能及时提取核酸，可将保存的样本放4℃存放7天；长期保存，可置于-20℃或-80℃。
b）灭活：
将采集管置于56℃灭活30分钟。
c）核酸释放：
室温条件下，将采集管振荡1分钟，静置5分钟，重复“振荡/静置”至少操作3次，然后瞬时离心，核酸即释放到保存液中，直接吸取上清液作为模板，加入到PCR体系进行扩增。
释放出的核酸可在室温放置48h，4℃存放1个月，-20℃或-80℃存放6个月。
4.4.3.5性能指标
a）样本存放在4℃可以稳定存放7天。
存放在-80℃可长期保存。
b）处理后的核酸模板可直接进行PCR检测，对PCR反应无明显抑制作用。
4.4.3.6注意事项
a）本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读本说明书。
b）为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜；样本的处理建议在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和处理均需符合相关法规要求：
卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》；
c）实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
d）使用无DNA/RNA酶的PCR反应管和吸头。
4.4.4新型冠状病毒（2019-nCoV）基因扩增检测
4.4.4.1原理：
本试剂盒基于一步法RT-PCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORF1ab探针采用Yellow标记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测。
4.4.4.2仪器设备：
ABI7500荧光定量扩增仪。
4.4.4.3操作
a）试剂准备（在试剂准备区操作），从试剂盒中取出NC（ORF1ab/N）PCR反应液A、NC（ORF1ab/N）PCR反应液B，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。
取N个（N＝待测样本个数+NC（ORF1ab/N）阴性质控品+NC（ORF1ab/N）阳性质控品）PCR反应管，单人份扩增体系配制如下表：
b）标本制备及加样（在标本制备区操作）
标本处理：
使用样本释放剂采样管直接采样送检：
将采样后的拭子高出采样管的部分折断，拭子头浸没在含有400uL样本释放剂的采样管中，拧紧管盖送检；将采样管置于56℃灭活30分钟；将采样管振荡30秒，静置15分钟使核酸释放。
使用核酸提取仪：
取200ul液体样本加入磁珠提取试剂样本孔位，使用smart32型核酸提取仪进行核酸提取（操作见smart32核酸提取仪及核酸或纯化试剂标准操作程序）
取出暂存的试剂（单管单人份PCR反应管），对应加入处理后的样品、阴性对照、阳性对照各5ul，6000rpm离心1分钟。
记录标本处理情况。
c）扩增（在扩增区操作）
将加好样的反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：
50℃15分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒55℃45秒（收集荧光），45个循环。
d）结果判定（ABI7500全自动分析仪器）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。
e）记录检测结果，签发检测结果报告。
4.5结果判断
4.5.1如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40，且Cy5通道有扩增曲线，可判样品未检测到2019新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA；
4.5.2如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，可判样品为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）阳性；
4.5.3如果检测样品仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一通道无扩增曲线，结果需复检，复检结果一致可判样品为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）阳性；复检均为阴性可判断为未检测到2019新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA。
4.6质量控制
NC（ORF1ab/N）阴性质控品：
FAM和VIC检测通道无明显扩增曲线，Cy5通道有明显扩增曲线；NC（ORF1ab/N）阳性质控品：
FAM和VIC检测通道有明显扩增曲线，Ct值≤32，Cy5通道有或无扩增曲线；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.7性能指标及线性范围
试剂分析灵敏度为500copies/ml，与2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体（如季节性甲型H1N1流感病毒，新型甲型H1N1（2009）流感病毒，甲型流感H3N2，H5N1，H7N9，乙型流感Yamagata，乙型流感Victoria，呼吸道合抱病毒A型，呼吸道合抱病毒B型，副流感I型，副流感II型，副流感III型，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D型，人间质肺病毒（人偏肺病毒），EB病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘—带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒（HKU1，OC43，NL63，229E），SARS冠状病毒，MERS冠状病毒）以及人基因组DNA无交叉反应。
4.8注意事项
a）本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读说明书；
b）为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜；样本的处理应在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和处理均需符合相关法规要求：
包括卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》；
c）产物处理：
PCR结束之后，产物容易引起污染，应由当天不再参与实验的人员将所有反应管放入生物安全垃圾处理袋或其他容器中确认完全封闭后方可丢弃；
d）全程应避免RNA酶污染，实验过程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。
在洁净消毒、紫外光杀菌的化学通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道；5.使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无DNA酶、RNA酶的离心管和吸头；
e）PCR检测试剂使用前要完全解冻，8,000rpm离心数秒后使用，但应避免反复冻融；7如果在样本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性；
f）实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增检测区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
g）实验完毕用10%次氯酸或75%酒精处理工作台和移液器，然后用紫外线灯照射20-30分钟；
h）完成样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用（24h内）；11.须对每次实验进行质量控制。
i）试剂保存运输及使用过程中多种因素可能导致性能变化，如保存运输不当、样本采集、样本处理及检测过程操作不规范等，请严格按照说明书操作。
因拭子等样本采集过程及病毒感染过程本身的特点，可能存在采集到的样本量不足等原因带来的假阴性结果，应结合临床其他诊疗信息综合判断，必要时复测。
5相关文件
5.1《新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）》。
5.2申子瑜李金明主编《临床基因扩增检验技术》北京：
人民卫生出版社，2002年9月第一版。
5.3卫生部文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》，卫检字【202】8号。
5.4Clinicalmanagementofsevereacuterespiratoryinfectionwhennovelcoronavirus（nCoV）infectionissuspected—Interimguidance.2020.
5.5《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》（第五版）
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