新城疫抗体水平检测定稿版.docx
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新城疫抗体水平检测定稿版
HUAsystemofficeroom【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝抑制试验
高若开
一、实验目的
1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容
1.血凝试验（HA）检测新城疫抗原
2.血凝抑制试验（HI）检测新城疫抗体
三、实验原理
1.血凝试验（HA）原理：
某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI）原理：
当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
四、实验材料
离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤
（一）抗凝剂的配制
将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制
1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA）
1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水
2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul
4.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟
5.结果判定
血凝效价测定
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2×
4×
8×
16×
32×
64×
128×
256×
512×
1024×
2048×
红细胞对照
生理
盐水
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
抗原
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
弃50
红细胞
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
结果
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋
＋＋
＋
－
－
－
－
结果判定标准
1、＋＋＋＋：
红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；
2、＋＋＋：
红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；
3、＋＋：
红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；
4、＋：
红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：
红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。
血凝价的判定
以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒的血凝价，即为一个凝集单位。
上表看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:
32，则l:
32为1个血凝单位，1:
16、l:
8分别为2、4个血凝单位，或将32/4=8，即1:
8稀释的病毒液为4个血凝单位。
（四）4个血凝单位抗原的配制
根据判定结果，吸取1毫升已稀释的病原溶液再以8倍稀释，即为4个血凝单位的标准抗原。
（五）血凝抑制试验
1、在血凝板上1－12孔内各加入50ul生理盐水；
2、在第1孔内加入被检血清50ul，然后倍比稀释至第11孔，最后弃50ul；
3、第1－12孔内加入4单位抗原50ul（第12孔为病毒对照）；
4、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul；
5、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟
6、结果判定
血凝抑制效价测定
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2×
4×
8×
16×
32×
64×
128×
256×
512×
1024×
2048×
病毒
对照
生理
盐水
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
血清
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
弃50
4单位抗原
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
红细胞
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
结果
－
－
＋
＋＋
＋＋
＋
＋＋
＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
－
结果判定标准
1、＋＋＋＋：
红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；
2、＋＋＋：
红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；
3、＋＋：
红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；
4、＋：
红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：
红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。
血凝抑制价的判定
将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数（10g2）表示。
如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：
4或HI效价为2（10g2）。
稀释
倍数
2×
4×
8×
16×
32×
64×
128×
256×
512×
1024×
2048×
血清
对照
结果
—
—
＋
＋＋
＋＋
＋
＋＋
＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
—
结果分析：
在对照出现正确结果的情况下，已完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。
（1）一般认为鸡的免疫临界水平为1:
8（成年）或1:
16（雏鸡），随地区不同而稍有差异。
（2）鸡血清HI抗体效价高于1:
16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:
16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。
（3）鸡群的HI抗体水平（血凝抑制滴度）是以抽检样品的HI抗体效价（㏒2）的几何平均值表示的。
如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价（㏒2）为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：
（8×3＋7×5＋6×2）/（3＋5＋2）＝7.1平均水平在4（10g2）以上，说明该鸡群为免疫鸡群。
若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。
（4）大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.1％一0.5％，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0％。
（5）鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
（6）若有10%以上的鸡群出现11（10g2）以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染。
若监测鸡群的免疫水平，用血凝抑制滴度在4（10g2）的鸡群保护率为50%左右；在4（10g2）以上保护率达90-100%；在4（10g2）以下的非免疫鸡群保护率约9%，免疫过的鸡群为43%。
六、注意事项
1、红细胞用前请摇匀。
2、用枪加样定要准确，尽量不要有气泡。
3、结果判定要有耐心。
4、HA和HI勿相混。
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