鉴定菌株的标准操作规程.docx
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鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
1.
欧阳光明（2021.03.07）
2.适用范围
本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
3.方法和原理
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。
16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。
16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16SrRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
357F
3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。
4.设备和材料
1.1
器材
移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；EppendorfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：
Veriti96WellThermalCycler；凝胶成像仪：
VersaDocMP4000；基因分析仪：
AB3500、AB3130
1.2试剂
DNA快速提取试剂：
PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：
Taq酶，10×TaqBuffer（Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：
BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；
1.3耗材
移液器吸头：
1000μL、200μL、10μL；离心管：
1.5mL、200μL；MicroAmpTMOptical96-WellReactionPlate；MicroAmpTMOpticalAdhesiveFilm；
1.4引物
16SrDNA
名称
序列
扩增长度
第1部分
正向引物27F
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
500bp左右
反向引物519R
5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'
第2部分
正向引物357F
5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
750bp左右
反向引物1115R
5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'
第3部分
正向引物926F
5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'
560bp左右
反向引物1492R
5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
其中M=C:
A,Y=C:
T.K=G:
T,R=A:
G,S=G:
C.W=A:
T;all1:
1
5.
操作流程
6.实验方法
1.5核酸提取：
挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μLddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。
提取的DNA于-20℃保存。
1.6基因扩增
1.6.1PCR反应体系
试剂
使用量（25μL体系）
模板DNA
2μL（10ng~100ng）
Taq酶（5U/μL）
0.2μL
10×TaqBuffer（Mg2+）
2.5μL
dNTPs（各2.5mM）
2μL
引物F（1μM）
5μL
引物R（1μM）
5μL
ddH2O
8.3μL
备注：
DNA模板量通常在100ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。
PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
1.6.2PCR反应条件
94℃：
10min
94℃：
30s
58℃：
30s
72℃：
45s
72℃：
5min
4℃：
∞
1.6.3电泳
称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。
PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。
1.7产物纯化
1.7.1每5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT试剂，混匀。
1.7.2放入PCR仪中，37℃温育15min,80℃温育15min。
1.7.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。
1.8测序反应
1.8.1测序反应体系
试剂
使用量（10μL体系）
模板DNA
1μL
引物（1μM）
1.6μL
BigDyeTerminator
1μL
5×SequencingBuffer
1μL
ddH2O
5.4μL
1.8.2测序反应条件
96℃：
2min
96℃：
30s
55℃：
15s
60℃：
4min
4℃：
∞
1.8.3测序反应纯化（BigDyeXTerminatorPurificationKit）
5.4.3.1每管加入27μLSAMSolution和6μLBigDyeXTerminatorSolution。
5.4.3.2放在EppendorfMixMate上2000rpm震荡30min。
5.4.3.3在离心机上以1000×g离心2min。
5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。
1.9序列比对
基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。
7.关键说明
1.1提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑取一菌环菌株，置于100μLddH2O中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50倍后做为PCR模板。
必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。
1.2PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后置于低温冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
1.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
具体参照附录。
PCR出现非特异性条带的原因：
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：
必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：
减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
模板浓度过高
10ul体系100ngDNA
附录
（资料性附录）
1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图
M：
DL2000；
1：
引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）
2：
引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）
3：
引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp）
2.细菌16SrDNA鉴定结果
1.116SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息：
菌株TL140924的鉴定结果
1.216SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息：
菌株70528的鉴定结果
1.316SrDNA的全序列信息：
菌株70528的鉴定结果
如附录2.2、2.3所示，当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。
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