AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程.docx

AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程.docx

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AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程

AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

文件名称

AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

使用维护标准操作规程

颁发部门

制订人：

复核人：

批准人：

质保部

制订日期：

复核日期：

批准日期：

执行日期

版本

1.0

编号

SOP04006

制作份数

_____份

发送部门

修订记录

修订人

修订原因

修订内容

版本

修订日期

1.目的：

确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2.范围：

适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。

3.定义：

无

4.职责：

荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。

质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。

5.内容：

5.1室内温度控制在15～30℃，相对湿度45～75%。

5.2仪器操作

5.2.1依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。

5.2.2接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。

5.2.3点击7500Softwarev2.3图标，打开软件。

5.2.4按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。

检测8联PCR反应管用**反应孔模块，检测96孔PCR反应板用**反应孔模块。

（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无需配平）

5.2.5再次按压托盘使其滑入仪器。

5.2.6新建扩增参数模板：

例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5cycles；（95°，10″；62°，35″）×40cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20μl反应体系。

5.2.6.1在Setup-PlateSetup-DefineTargetsandSamples中，将TargetName下的Target1改成FAM；点击AddNewTarget，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。

5.2.6.2在Setup-RunMethod-GraphicalView中的ReactionVolumePerWell后面输入20（20μl反应体系）。

选中第一个HoldingStage，点击DeleteSelected删除；在CyclingStage中的NumberofCycles后输入5，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将63度下面收集荧光图标点掉；点击AddStage下拉菜单选择Cycling，在CyclingStage中的NumberofCycles后输入40，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35秒，在62度下面点击图标收集荧光。

5.2.6.3点击Save下拉菜单下的SaveAsTamplate，文件名输入UG-63-62，保存在默认ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。

5.2.7已有扩增参数模板：

在软件Home界面中点击Template，选择需要的模板，点击打开。

例如：

UG-63-62，其扩增参数就是95°，10′；（95°，10″；63°，45″）×5cycles；（95°，10″；62°，35″）×40cycles，在62°时收集荧光信号（HEX、FAM信号），ReactionVolumePerWell:

20μl（20μl反应体系）。

5.2.8在Setup-PlateSetup-AssignTargetsandSamples中选择8联管摆放的位置，全部勾选Sample1；UGT1A1*6勾选HEX，UGT1A1*28勾选FAM。

5.2.9在Run-AmplificationPlot中点击STARTRUN，命名为20140101-1（当日日期+当日上机次数，例:

2014年1月1日第1次上机编号为20140101-1），保存在默认文件夹中，开始运行。

5.2.10结果分析

5.2.10.1PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。

5.2.10.2也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20），Threshold值（Rn）推荐设定为5000～15000，点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值。

5.2.11实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。

5.3仪器维护

5.3.1每周维护

5.3.1.1检查计算机磁盘空间。

如需要，将实验文件归档或备份。

•至少每周检查一次计算机磁盘空间。

•如果硬盘的可用空间不足其总容量的20%，应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。

5.3.1.2关闭控制7500Instrument的计算机，30秒后再次开启计算机。

5.3.1.3用无绒布块（不脱毛）蘸取75%酒精清洁7500Instrument的表面。

（注：

切勿使用有机溶剂清洁7500Instrument。

）

5.3.1.4使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。

5.3.2每月维护

5.3.2.1执行背景校准。

（可执行一次背景校准以检查是否存在污染物）

5.3.2.2运行磁盘清理和磁盘碎片整理。

•至少每月一次。

•当Windows®操作系统显示消息提示执行碎片整理时。

•切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500Real-TimePCRSoftware。

5.3.3每半年（6个月）维护

5.3.3.1检查灯具状态。

①在7500Software中，选择Instrument→LampStatus/Replacement以确定卤素灯的状态。

显示LampStatus/Replacement对话框：

•Condition–表示以下其中一种状况：

–Good–灯具工作良好，不需要更换。

单击Close。

–Failed–必须更换灯具。

单击Close，然后按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。

–ChangeSoon–灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。

单击Close，然后决定是否更换灯具。

如果决定更换，请按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。

•Usage（Hours）–灯具已照明的总小时数。

•LampCurrent–灯具的输出电流，以安培为单位（A）。

低电流意味着灯具可能将要失效。

•DateLastReplaced–上次更换灯具的日期。

②在执行一次运行之前或期间，7500Software可能显示以下警告：

消息

描述

Warning–Cannotdetectsufficientcurrentfromlamp.Eitherlampisnotinstalledproperlyorneedstobereplaced.

在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。

在按照5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。

Warning–Cannotdetectsufficientcurrentfromlamp.Eitherlampisnotinstalledproperlyorneedstobereplaced.

7500Software停止了该次运行，因为在运行中灯具电流下降到可接受水平之下。

在按照5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。

在消息框中单击OK，检查仪器日志，然后更换灯具。

Warning-Thelampusagehasexceeded2000hr.Werecommendreplacingthelampsoontoensureoptimalassayperformance.

在运行开始时，灯具使用时间超过2000小时。

单击CancelRun，然后更换灯具，或者单击ContinueRun。

重新运行ROI、背景、光学和染料校准。

5.3.3.2执行目标区（ROI）校正。

5.3.3.3执行背景校准。

5.3.3.4执行光学校准。

5.3.3.5执行染料校准。

5.3.3.6执行RNaseP仪器验证试验。

5.3.4其它维护任务（需要时执行）

5.3.4.1样本块污染清除。

执行以下程序，去除7500Instrument样本块的荧光污染。

荧光污染是导致背景运行失败的常见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出异常的高信号。

注意！

切勿移去设备上的盖板。

7500Instrument中没有用户可安全维修的组件。

如果怀疑存在问题，请联系生产商服务代表。

①全程戴上一次性无粉手套操作。

②找到样本块中受污染的反应孔（参阅5.4.2.13“如何确定污染”）。

③从7500Real-TimePCRInstrument中取出反应板和托盘支架。

a.按压托盘门，将其打开。

b.取出反应板和托盘支架。

c.关闭托盘门。

以一定角度向托盘右侧施加压力。

④手动降低样本块：

a.在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。

c.在ROIInspector对话框中，单击MoveBlock。

d.当ROIInspector对话框显示“BlockDown”时，单击Done。

⑤关闭7500Real-TimePCRInstrument，然后拔下其电源电缆。

允许仪器冷却15分钟。

⑥打开7500Real-TimePCRInstrument的检查门。

a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。

b.打开仪器前门。

⑦抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的背面。

⑧使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔：

a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。

b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。

c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。

d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。

e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。

⑨7500Real-TimePCRInstrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。

抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。

⑩打开7500Real-TimePCRInstrument的检查门。

⑪插上电源插头并开启7500Instrument。

⑫通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅5.4.2“背景校准”）。

⑬如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔：

a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。

b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。

c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。

重要！

使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。

⑭重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。

⑮如果污染仍然存在，重复步骤②至⑦，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应孔：

a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。

b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。

c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。

重要！

使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。

⑯重复步骤⑧至⑫，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。

如果仍有污染，请与生产商技术支持联系。

⑰确保受热盖门完全关闭并上闩。

如果没有，则7500Software显示错误消息。

5.3.4.2移动PCR仪。

（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染料校准以及RNaseP仪器验证。

）

5.3.4.3更换卤素灯。

①全程戴上一次性无粉手套操作。

②关闭7500Instrument，然后拔下其电源电缆。

允许仪器冷却15分钟。

a.注意！

灼热。

7500Instrument和灯具灼热！

灯具在使用中会变得非常灼热。

在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。

b.重要！

为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。

c.注意！

7500Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。

③打开7500Instrument的检查门。

a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。

b.打开仪器前门。

④从仪器中取出灯具：

a.向下滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。

ab

⑤查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）。

⑥将新灯具安装至仪器上：

a.向上滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到位。

⑦关闭仪器前门。

⑧插上电源插头并开启7500Instrument。

⑨打开ROIInspector对话框：

a.在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。

⑩在ROIInspector对话框中，选择LampControl→Idle。

⑪当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Done。

⑫如果灯具发光，在7500Software中选择Instrument→LampStatus/Replacement，单击ResetLampTimer，然后单击OK。

如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。

重新更换灯具。

如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第71页）。

⑬更换灯具后，按顺序执行以下校准。

请参阅：

•5.4.1目标区（ROI）校准

•5.4.2背景校准

•5.4.3光学校准

•5.4.4染料校准

•5.4.5验证仪器性能

5.3.4.4更换7500Instrument保险丝。

①保险丝损坏时，更换7500Real-TimePCRInstrument保险丝。

（注意！

为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。

）

②全程戴上一次性无粉手套操作。

③关闭仪器电源，并拔下电源插头。

④使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。

⑤将每一个保险丝从其保险丝座中取出，然后检查是否损坏。

损坏的保险丝内部通常有炭黑覆盖。

⑥使用12.5A、250V、5×20mm保险丝更换损坏的保险丝。

注：

电压和电流额定值见保险丝座。

⑦安装保险丝座。

⑧插上电源插头，然后开启仪器。

如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。

注：

保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。

为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。

5.3.4.5更新Windows®操作系统。

5.3.4.6更新7500Software。

5.3.4.7监控仪器状态（使用FunctionTest对话框对主要7500Instrument组件执行高级诊断。

一般情况下不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者LifeTechnologies代表指示这样做。

）

①在7500Software中，选择Instrument→Function-Test。

②根据需要执行功能测试。

要测试：

●所有组件–单击AllTests，然后等候软件执行所有功能测试。

●一个或多个特定组件–单击以下其中一项或多项。

•USB–测试7500Real-TimePCRInstrument和计算机之间的通用串行总线（USB）连接。

如果7500Software能够和7500Real-TimePCRInstrument建立通信，则表示测试通过。

•CCD–测试7500Real-TimePCRInstrument内的CCD摄像机。

如果摄像机能够拍摄图像，则表示测试通过。

•FilterWheel–测试7500Real-TimePCRInstrument内的过滤轮。

如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

•Shutter–测试7500Real-TimePCRInstrument的光学快门。

如果快门控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

•Lamp–测试7500Real-TimePCRInstrument的卤素灯。

如果灯具控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

•ThermalCycler–测试7500Real-TimePCRInstrument内的热循环仪样本块。

如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。

当7500Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供结果描述。

③结束测试时，单击Close。

5.4仪器校准

5.4.1目标区（ROI）校准

5.4.1.1全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.1.2从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。

5.4.1.3让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。

在立即运行反应板之前，不要从包装袋内取出ROI校准反应板。

反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。

长时间曝光可降低染料在反应板中的荧光。

5.4.1.4从包装袋中取出ROI校准反应板。

将光学薄膜留在反应板上。

不要丢弃存放ROI校准反应板的包装袋。

若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。

5.4.1.5振荡ROI校准反应板5秒钟。

5.4.1.6用板式离心机将反应板离心2分钟。

ROI校准反应板必须充分混合并离心。

5.4.1.7确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。

如果不是，则以更高的转速及更长的时间离心反应板。

5.4.1.8按压托盘门，将其打开。

将反应板装入仪器中的反应板架。

确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。

（装入标准反应板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。

）

5.4.1.9以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。

5.4.1.10执行自动ROI校准

①在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

②在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartCalibration。

③按照向导的指示，完成校准。

ROICalibration对话框显示三个选项卡：

•Setup–显示ROI校准设置说明。

单击Next提示可以打开Run选项卡。

•Run–单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。

单击Next提示可以打开Analysis选项卡。

•Analysis–指明校准状态（Passed/Failed）。

如果校准失败，请参阅5.4.1.13“排除ROI校准故障”。

5.4.1.11执行手动ROI校准

①在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

②在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。

③在ROIInspector对话框中（如图1）：

a.在ExposureTime字段中，输入2048。

b.选择FilterA（滤光器1）。

图1

④单击Snapshot，生成一张ROI图像。

⑤确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。

可接受图像中的反应孔：

•在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。

（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则显示一条警告。

）

•可以含有但不是必须含有红色像素（表示饱和）。

未饱和

正常饱和

过度饱和

可接受

不可接受

⑥如果ROI图像可接受，转至步骤⑦。

如果ROI图像过饱和，将ExposureTime降低一半，然后单击Snapshot。

重复执行，直至获得可接受的ROI图像。

如果无法获得可接受的图像，请参阅5.4.1.13“排除ROI校准故障”。

⑦单击GenerateCalibration。

7500Software采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图像：

如果软件显示：

执行：

或

a.单击OK。

b.将ExposureTime降低一半（参阅5.4.1.11步骤③a）。

c.重复步骤③和⑤。

ROI图像非常模糊或者无法成功校准。

请参阅5.4.1.13“排除ROI校准故障”。

可接受的校准图像

注：

在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。

注：

绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。

验证以下各项：

•WellsFound值为96。

成功校准–WellsFound必须为96。

•在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。

⑧单击SaveCalibration。

软件保存滤光器1新产生的ROI校准。

在ROIInspector的FilterMasksLoaded区域，“OK”出现在滤光器1旁边。

⑨对其余滤光器重复步骤③至⑧，对每个滤光器执行校准之前，将ExposureTime重置为2048。

当所有滤光器的FilterMasksLoaded都显示OK时，ROI校准完成。

当所有滤光器的FilterMasksLoaded都是OK时，校准完成。

⑩点击Done。

5.4.1.12拆卸反应板（注意！

灼热。

仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。

若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。

）

①取出校准反应板：

a.按压托盘门，将其打开。

b.取出校准反应板。

c.按压托盘门，将其关闭。

②将校准反应板放入其包装套中。

如果要执行背景和光学校准：

a.在接下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。

光学校准使用ROI校准反应板。

b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。

c.重要！

不要丢弃校准反应板。

如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。

d.重要！

执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。

5.4.1.13排除ROI校准故障

问题/症状

可能原因

行动

ROI校准失败

样本块可能