实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测-教案.doc

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授课教师常祖明学生人数55

课题PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测

授课类型新授课授课方法讲授、演示

教学用具多媒体、实验室设备

教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学会琼脂糖凝胶电泳的操作技术

教学重点琼脂糖凝胶的制备及点样操作

教学难点理解琼脂糖凝胶电泳的原理

教学过程

一、实验目的

1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理

2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法

二、实验原理

1.DNA琼脂糖凝胶电泳的原理

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

（1）电荷效应

DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。

【等电点】

在某一pH的溶液中，DNA分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该DNA分子的等电点，用pI表示。

当DNA溶液pH＞pI，-

当DNA溶液pH＜pI，+

当DNA溶液pH=pI。

溶解度最小。

（2）分子筛效益

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比，所以不同相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。

2.溴化乙锭对DNA分子进行染色的原理

观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。

三、实验器材

1.电泳仪

北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN型

2.移液枪：

5µl

3.微波炉

4.锥形瓶：

250ml

5.线手套

6.容量瓶：

1000ml

7.紫外分析仪

四、实验材料与药品

实验材料：

实验五中鸡血DNAPCR产物

1.DNAMarker

作用：

主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。

商品信息：

2000bp，50次，紫色液体

理化性质：

DNAMarker是分子量不同的DNA片段，主要成分Tris-HCl、EDTA、甘油、溴酚蓝

储存：

短期4℃保存，长期-20℃保存。

危害：

避免与皮肤眼睛接触。

2.GoldView核酸染色剂

作用：

一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µlGoldView™即可。

在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

商品信息：

1ml/瓶

理化性质：

储存：

室温保存2年。

危害：

虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。

【使用方法】

1.将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。

　　2.加入5µlGoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。

　　3.冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。

4.电泳完毕在紫外灯下观察。

【注意事项】

　　1.胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。

　　2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

3.琼脂糖

作用：

制备琼脂糖凝胶原料，分离和鉴定核酸。

商品信息：

100g/瓶

理化性质：

琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。

储存：

阴凉干燥处密闭储存。

危害：

无

4.三羟甲基氨基甲烷（Tris）

作用：

生物缓冲剂，用于凝胶电泳配置缓冲液。

商品信息：

500g/瓶

理化性质：

是一种白色结晶或粉末。

溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：

有吸湿性，在阴凉干燥处密闭储存。

危害：

对眼睛、皮肤、呼吸道有刺激作用。

5.硼酸

作用：

TBE缓冲液成分之一。

商品信息：

分析纯，500g/瓶

理化性质：

为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶，有滑腻手感，无臭味。

溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中，水溶液呈弱酸性。

储存：

阴凉干燥处密闭储存。

危害：

有刺激性。

6.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：

螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。

商品信息：

瓶/250g。

理化性质：

无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。

溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。

可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：

于阴凉、通风的库房。

远离火种、热源。

应与氧化剂分开存放，切忌混储。

配备相应品种和数量的消防器材。

储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：

对粘膜和上呼吸道有刺激作用。

对眼睛、皮肤有刺激作用。

本品可燃，具刺激性。

7.6×DNALodingBuffer

作用：

第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

商品信息：

5ml/瓶。

含溴酚兰、二甲苯青和甘油等，按5ul样品加1ulBuffer，混匀直接上样。

理化性质：

储存：

2-8℃两年。

危害：

有刺激性。

五、实验试剂

1.0.5×TBE（PH8.0）缓冲液

【5×TBE缓冲液（PH8.0）】母液

{Tris108g+硼酸27.5g+0.5MEDTA20ml}®定容到1000ml®高压灭菌®4℃保存

临用时用水稀释10倍®0.5×TBE缓冲液（PH8.0）

【0.5MEDTA（PH8.0）溶液】

水800ml+EDTA-2Na186.1g®剧烈搅拌®用NaOH调pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）®定容至1L®分装后高压灭菌备用。

注意：

EDTA-2Na在PH值接近8.0时才能完全溶解。

2.1.0%琼脂糖溶液

琼脂糖0.5g+0.5×TBE缓冲液50ml®放入锥形瓶中混匀®微波炉中加热溶解

六、实验步骤

（一）1%琼脂糖凝胶的制备

1.选择合适的凝胶托盘放置于制胶器的合适区域。

2.称取1g琼脂糖置于250ml锥形瓶中，加入100ml0.5×TBE缓冲液。

3.将锥形瓶放入微波炉中加热使琼脂糖充分溶解。

4.将5µlGoldView核酸染色剂加入其中，摇晃充分混匀。

5.待胶冷却至60度左右，将融化的琼脂糖小心的倒入制胶器中，速度要快，再把梳子（试样格）插入凝胶托盘两边槽内。

6.让胶自然冷却至完全凝固（约需20-30分钟）。

小心的将梳子拔出（注意先拔一侧），将胶连同凝胶托盘放入电泳仪中，加入0.5×TBE缓冲液，使缓冲液没过凝胶1-2mm（注意加样孔靠近负极一端）。

如样品孔内有气泡，应除去。

（二）加样

1.将适量的DNAMarker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。

2.在PCR产物中加入6×DNALodingBuffer（每5ul产物加入1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加2ul。

3.盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，注意不要接错正负极。

4.调好电压，打开电源开始电泳，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。

切断电源后，再取出凝胶。

（三）凝胶紫外观察：

凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。

七、注意事项

1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。

2.制胶和加样过程中要防治气泡的产生。

3.必须戴手套操作，严格注意防护。

4.加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。

5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。

6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。

负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。

将两者混匀后加入点样孔，注意枪头尽量往下，同时防止气泡产生。

八、思考题

影响DNA迁移速率的因素有哪些？