柏树内生真菌的分离与抑菌研究.docx

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柏树内生真菌的分离与抑菌研究

柏树内生真菌的分离与抑菌研究

学院：

生命科学学院

年级：

2004级

专业:

制药工程-生物制药

姓名：

学号：

指导教师：

目录

摘要…………………………………………………………………………………………i

Abstract……………………………………………………………………………………ii

1.前言………………………………………………………………………………………1

1.1植物内生真菌………………………………………………………………………1

1.1.1内生菌概念…………………………………………………………………1

1.1.2植物内生真菌………………………………………………………………1

1.2植物内生真菌研究现状及应用……………………………………………………2

1.2.1抗肿瘤活性物质……………………………………………………………2

1.2.2抗菌活性物质………………………………………………………………2

1.2.3产酶的内生菌………………………………………………………………3

1.2.4抗虫抑菌类物质……………………………………………………………3

1.2.5植物生长调节物质…………………………………………………………3

1.2.6产香气的内生真菌…………………………………………………………4

1.2.7生物防治……………………………………………………………………4

1.2.8其他作用……………………………………………………………………4

1.3白蚁及白蚁的危害…………………………………………………………………4

1.3.1白蚁…………………………………………………………………………4

1.3.2白蚁的危害…………………………………………………………………5

1.4白蚁的防治…………………………………………………………………………7

1.4.1物理防治法…………………………………………………………………7

1.4.2化学防治法…………………………………………………………………7

1.4.3生物防治法…………………………………………………………………8

1.5本试验研究的目的及意义…………………………………………………………8

2.材料与方法………………………………………………………………………………10

2.1材料及设备………………………………………………………………………10

2.1.1分离内生菌所用树木及指示菌…………………………………………10

2.2.2培养基……………………………………………………………………10

2.2.3主要仪器设备……………………………………………………………10

2.2试验方法…………………………………………………………………………11

2.2.1内生真菌的分离…………………………………………………………11

2.2.2内生真菌的纯化…………………………………………………………11

2.2.3摇瓶培养…………………………………………………………………12

2.2.4牛津杯法抑菌实验………………………………………………………12

3.结果与分析………………………………………………………………………………14

3.1柏树木内生真菌的分离…………………………………………………………14

3.2活性筛选结果……………………………………………………………………14

4.讨论………………………………………………………………………………………18

5.结论………………………………………………………………………………………19

参考文献……………………………………………………………………………………20

附录…………………………………………………………………………………………22

致谢…………………………………………………………………………………………23

摘要

植物内生真菌作为生活在植物组织内部的一大类微生物，在其生活史的一定阶段或全过程中对宿主不表现出明显病症。

在长期共同进化过程中，植物内生菌与宿主植物之间形成了一种共生关系。

香柏和罗森绘具有天然的抗白蚁特性，按照基因可互相传递的原则推测，香柏的内生菌可以产生对白蚁有抑制作用的活性物质。

因此本实验旨在从具有天然抗白蚁树木的树枝、树皮中分离出能抗白蚁的内生真菌。

利用白蚁体内共生菌作指示菌，采用牛津杯法做抑菌试验，得到抑菌功能效果好的菌株HDF-I-217和HDF-I-232。

下一步将对该两株菌进行鉴定，提取其代谢产物用于防治白蚁，这将具有极大的开发利用价值。

关键词

内生真菌；白蚁；分离

Abstract

Asabiggroupofmicrobeinhabitinginthetissuesoflivingplants,theendophyticfungihavenosignifieantlynegativeeffectsonthehostplantsduringtheirwholelifehistoryorsomephases.Duringthelongprocessofthecommonevolution,asymbiosissystemformedbetweenendophytesandhost.

Port-orford-cedarandeasternredcedarhavethenaturalcharacterofanti-termite.Accordingtotheprincipleofthegenesmutuallytransmittingbetweentheplantandtheendophytes,itissupposedthattheendophytefromPort-orford-cedarcanproduceactivecompoundwhichhasinhibitionfortermite.Sotheresearchseparatestheendophyticfungifromthebranchandthepillofthenaturalanti-termitetrees.WeobtainedthedominanceendophytesnamedHDF-I-217andHDF-I-232bythecylinderplatemethodinthemicrobiostaticexperiment,theycaninhibitthemicrobeswhichliveinthetermitegut.Thenextstepwewillidentifythetwofungiandextractmetabolitesforpreventingandcontrollingtermite,whichwillhaveagreatdevelopmentofvalue.

Keywords

endophyticfungi;termite;isolation

1.前言

1.1植物内生真菌

1.1.1内生菌概念

对内生菌的定义认识是不断发展的。

首先由DeBary提出，内生菌是指生活在植物组织内的微生物，以区分那些生活在植物表面的表生菌（Epiphyte）；后来Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，这个内生菌概念不包含植物致病菌和菌根菌[1]。

目前，内生菌概念是由Stone等提出的，是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物（至少暂时）不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来注明其内生[2]。

也就是说我们可以把植物内生菌理解为生活于植物组织内的正常菌群，不仅包括互惠共利的内共生微生物，也包括潜伏在宿主植物体内的病原菌[3]。

1.1.2植物内生真菌

植物内生菌主要有细菌、真菌和放线菌。

内生真菌（Endophyticfungi）是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。

近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物。

植物与内生真菌呈互利共生的关系：

一方面，植物为内生真菌提供光合产物和矿物质；另一方面，内生真菌产生的代谢物，或能刺激植物的生长发育，或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力。

这些代谢物中的一部分，正是应用前景广阔的新型生物活性物质，有很高的开发利用价值[4]。

1.2植物内生真菌研究现状及应用

内生真菌广泛存在于健康植物组织内部，是植物微生态系统的重要组成部分。

内生真菌产生的各种活性物质，在生物制药、农业生产、工业发酵等方面都表现出美好的应用前景，受到世界各国专家的广泛关注。

利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足人们日益增长的需求；同时有利于珍稀、濒危药用植物资源的保护，对减少野生药用植物多样性的破坏具有重要意义。

药用植物具有丰富的物种多样性，是人类生存与发展的重要自然资源。

各种药用植物中蕴藏着非常丰富的内生真菌。

通过与药用植物的“协同进化”，某些内生真菌具有了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。

1.2.1抗肿瘤活性物质

植物中极低的含量和植物资源的有限是人类规模利用这些化合物所面临的主要困难。

这造就了从红豆杉等植物中去寻找能产生紫杉醇的内生真菌。

从红豆杉的内生真菌中不仅分离出了紫杉醇，现已从红豆杉及其近缘植物分离到了许多种产紫杉烷类化合物的内生菌。

落羽松（Taxodiumdistchum）、榧树（Torreyagrandifolia）、银杏（Ginkgobiloba）、秃柏（Toxodiumdistichum）以及一种松树（Wollemianobilis）中都分离到了能产生紫杉醇的内生菌，这为紫杉醇的来源问题提供了很好的解决办法[5]。

以中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）株作为模型，对喜树内生真菌次生代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验，结果表明从喜树的树皮和树枝中均分离了能产生抑制CHO细胞增殖活性的内生真菌[6]。

郭智勇等[7]从三种红树林内生真菌Paecilomycessp.（treel-7），4557，ZZF65中分到九个环肽类的次级代谢产物，其中得到的环Pro-Leu具有强的抗癌活性及特殊的抗菌活性而被称为灭癌素。

1.2.2抗菌活性物质

多种药用植物本身具有抗菌消炎作用，因此其内生真菌也是筛选抗病原菌菌株的理想途径，已有多种药用植物内生真菌被研究过抑菌活性。

从黄花夹竹桃分离到的内生真菌中有17株具有抑菌活性，其中一株木霉（Trichodermsp.）抑菌活性最强，抗菌谱最广[1]。

Wagenaar等[8]从薄荷的一株内生真菌Phomopsislongicolla的培养物中，分离提取出一种新的抗生素——dicerandrols，它具有很强的杀菌作用。

目前人们已知的抗生素远不能满足需求，植物内生真菌是一个未开发的新领域，它们所产生的抗生素活性成分往往是新颖的。

因此，开发植物内真生菌为寻找新的抗生素提供了具有广阔的前景。

1.2.3产酶的内生菌

近年来，关于内生菌产酶的报道越来越多，利用内生菌产生的酶体系经过筛选可用于有机合成、新药开发等领域，是丰富天然产物的又一新途径。

内生真菌产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、纤维素酶、醋酶等胞外酶。

有些酶具有较高的商业应用价值。

2001年Stamford等人发现从薯蓣属蚕豆中分离出来的内生放射形拟诺卡菌可以产生耐热性α-淀粉酶；次年，又发现玉米叶中的内生真菌链孢子囊菌在pH8.0的淀粉-Czapek培养基上可以高效产生耐热葡萄糖淀粉酶[9]。

1.2.4抗虫抑菌类物质

内生真菌可增强宿主对病虫害的抵抗能力，这是因为有的内生真菌在宿主内和纯培养中产生有毒物质，如有机胺类，麦角生物碱等。

这些内生真菌的代谢产物可对植物致病菌和有害昆虫产生抗性。

国内外关于内生真菌在农药领域的研究与开发尚处于起步阶段，报道极少，，因此值得深入研究与开发。

从药用植物海金沙中筛选抗小麦赤霉菌、番茄早疫霉菌、番茄灰霉菌等植物病原真菌的内生真菌，并进行活性物质检测。

结果表明80％以上的内生真菌对3种农作物病原真菌具有较强的抗菌活性[10]。

从除虫菊的根、茎、叶和花中分离出内生真菌其发酵液10倍稀释液至少对供试的番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌（Exserohilumturcicum）、小麦纹枯病菌和小麦赤霉病菌等6种病原菌中的一种抑菌活性达75％以上[11]。

1.2.5植物生长调节物质

内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有很重要的作用。

内生真菌能产生促进植物生长的物质如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。

内生真菌也能通过增强植物吸收N、P等营养元素，或与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而间接促进植物生长。

研究发现，金线莲等4种兰科药用植物的内生真菌能够产生赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、玉米素（Z）、玉米素核苷（ZR）等植物生长调节剂[12]。

1.2.6产香气的内生真菌

从香料植物香茅草上分离到一株产香内生菌XCY-1，液体发酵后分析鉴定其发酵液的挥发性成分，共鉴定出74个化合物，其中有乙缩醛二乙醇、柠檬烯、月桂烯、月桂醛等多种香料物质。

产香内生菌给新的香料资源开发提供了理论依据[13]。

1.2.7生物防治

植物内生真菌的专一性很强，除了对其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，对其他生物没有直接影响，而且内生真菌还可通过人工接种被导入不同的植物并可通过宿主的种子进行遗传；内生真菌分布于植物组织内，有足够的碳源、氮源，而且受到植物组织的良好保护，具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用，因而具有作为生物农药的优良特性。

兰琪等[14]从苦皮藤（Celastrusangulatus）植株中分离到39株内生真菌，其中3株内生真菌发酵产物的丙酮提取物对番茄灰霉病等6种病菌的菌丝生长有较强的抑制作用。

在盆栽试验中，内生真菌发酵产物的丙酮提取物对供试病菌的治疗和保护作用均在50％以上，有的内生真菌在一定条件下可成为拮抗菌。

由此可见，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌。

但内生真菌提高植物抗病性的机制，以及内生真菌如何影响寄主防御相关的酶系活性还不清楚。

1.2.8其他作用

药用植物内生真菌具有一些其他有益的生理作用，如除草活性、抗结核、抗疟、免疫抑制作用、抗氧化，降解纤维素、保鲜等[12]。

1.3白蚁及白蚁的危害

1.3.1白蚁

白蚁属于昆虫纲（Insects）等翅目（Isoptera），是地球上最古老的社会性昆虫，距今大约有2.5亿年的历史。

全世界有大约2600种白蚁，我国有500余种。

白蚁在分类上的地位和名称经历了100多年的不稳定。

从解剖学和社会组织性特征可以把白蚁分为两大类群，即低等白蚁，包括澳白蚁科（Mastotermitidae）、木白蚁（Kalotermitidae）、草白蚁科（Hodotezmitzdae）、原白蚁科（Termopsidae）、鼻白蚁科（Rhinotermitidae）、齿白蚁科（Serritermitidae）和高等白蚁即白蚁科（Termitidae）共七个科。

高等白蚁较低等白蚁有更细致的内外部解剖学特征和更强的社会组织性。

低等白蚁吃木质性食物（吃草的草白蚁除外），肠内有原生动物和细菌共生；白蚁科占白蚁总数的75％，吃树、草、凋落物和含矿物质的土壤，有丰富的肠细菌共生，但原生动物很少见[15]。

白蚁属社会性群体生活昆虫，并有复杂的组织分工。

在一个群体内的个体，从形态和分工上可分为两大类型，即生殖型和非生殖型。

生殖型为有性的雌蚁和雄蚁，它们的职责是保持旧群体和创立新群体。

在这个类型中有大翅型或有翅型，短翅型，无翅型三个品级。

非生殖型是指没有生殖能力的白蚁。

它们无翅，生殖器官已经退化，主要担负劳动和作战的任务，因而又有工蚁与兵蚁之分。

白蚁作为社会性昆虫的类群之一，低等白蚁与肠道微生物共生是其特征，很多研究者经常选择其作为研究材料。

白蚁肠道呈螺旋状，其中存在着原生动物，发酵性螺旋体，同型产乙酸细菌，甲烷细菌和硫酸盐还原菌，它们对白蚁消化木质纤维素类食物有着重要作用[16]。

1.3.2白蚁的危害

作为森林“分解者”，白蚁对森林的物质循环起了很大作用；反之，作为木材害虫，它给人类带来了各种危害。

白蚁是喜温性昆虫，只要具备了适宜的温度，湿度和食物等条件，就能很快的繁殖，扩散。

白蚁的繁殖危害可造成严重的损失，全世界每年直接和间接的损失达数十亿美元。

由于白蚁危害的严重性和广泛性而引起了人们的重视。

在欧洲，散白蚁（Reticulitermes）造成的财产损失最大，仅法国每年损失就达2亿欧元。

在意大利、西班牙、葡萄牙和希腊，白蚁对建筑的侵害也很严重，很多具历史意义的建筑被严重损坏。

随着欧洲经济复苏，在5年内，年除害处理费用至少达到10亿欧元。

在北美洲，白蚁被视为主要经济害虫，仅美国，被调查地每年白蚁防治和损失维修费在10亿美元以上。

1.3.2.1白蚁对建筑物的破坏

白蚁对建筑物的破坏，特别是对砖木结构、木结构建筑的破坏，由于其隐蔽在木结构内部破坏或破坏其承重部位，往往造成房屋突然倒塌，导致财产损失和人员伤亡，引起人们的极大关注。

近年来，随着钢筋混凝土建筑的增多，被白蚁破坏造成倒塌的危险性的比率是在逐步降低。

但是，新的大厦内部木结构仍可遭受白蚁破坏。

白蚁不仅危害木结构，而且它分泌的蚁酸也可以腐蚀金属。

因此，新建房屋必须进行白蚁预防处理。

1.3.2.2白蚁对堤坝的破环

在我国南方诸省、区的堤坝白蚁危害极为普遍，堤坝白蚁主要危害种类是土白蚁属和大白蚁属，在中国有广泛的分布。

尤其是长江流域及其以南的江河堤围和山塘水库，普遍遭受白蚁的危害，常常出现蚁患险情和灾难。

这些白蚁在堤坝内2-3m甚至更深处，修筑直径达lm以上的巢，密集营巢，蚁道四通八达，有些蚁道甚至穿通堤坝的内外坡。

当汛期水位升高时，常常出现管涌、滑坡、垮坝险情。

1.3.2.3白蚁对农作物的危害

白蚁可以危害花生、木薯、桑、茶、玉米、小麦、水稻等农作物，尤其对甘蔗的危害十分严重。

另外，白蚁对杨梅、山核桃、杉木、樟树、按树、刺槐、垂柳、悬铃木、白杨、重阳木、拐枣等林木、果树等的危害也具有相当的广泛性和严重性。

在南方丘陵地区，杉木林基地的蚁害率一般达40％～60％。

在广州市郊区，公路两旁的按树蚁害率达90％以上。

1.3.2.4白蚁对通讯设备的破坏

埋地塑料电缆和通讯设备也常遭白蚁蛀食。

在南方，白蚁造成的通讯电缆故障占总故障率60％，广东省则高达80％。

电力电缆被白蚁咬穿护层后，还易引起短路，导致电力转送中断，甚至酿成火灾。

据报道，我国南方已有12个省、市、自治区，发现白蚁破坏埋地塑料电缆情况。

1.3.2.5白蚁对其他物品的危害

白蚁还能危害图书、文物、织物、武器、账册、钱币、地下电缆等，造成重大损失。

1.3.2.6白蚁对生态环境的危害

据统计世界上的白蚁群每年向大气排放2000万吨蚁酸，蚁酸产生化学物质，污染大气，此项污染已超过了汽车和工业烟雾对环境造成的污染。

目前各国肿瘤专家认为：

空气越污染，癌症的发病率就越高。

由此看来白蚁是个不可忽视的祸根[17]。

1.4白蚁的防治

1.4.1物理防治法

使用简单工具、机械及利用光、热、电等来防治白蚁的方法，它具有杀蚁直接、不造成环境污染、不破坏木材等被处理物的特点，特别适用于文物、木竹制品等白蚁的防治。

主要有：

人工挖取白蚁巢，利用射线，热能，电能防治白蚁以及灯光诱杀等。

物理屏障技术，主要是利用砂子、玄武岩石子颗粒、金属网、金属板和PVC板等物质作为物理或机械屏障，防止白蚁进入建筑物内造成危害的方法。

是利用白蚁只能通过1mm以上的空隙，但不能用口器搬运直径大于1mm的石头颗粒的特点，设计障碍物阻止白蚁通过。

这种方法的优点主要是能预防白蚁进入建筑物内进行为害，而不是驱赶或灭杀接近建筑物的白蚁；可结合建筑物施工时完成，花费不高，对环境友好。

不足的是未能阻止分飞的蚁群进入建筑物。

在澳大利亚、加拿大和美国的夏威夷，这种技术投入商业运用已超过10年，申请了多个专利。

物理屏障法可根据需要采用以下几种屏障材料：

筛网，石头颗粒，防护板，防水膜和钢结构等[18]。

物理防治虽然具有无污染、无残留、无毒害等优点，且有的措施还能在短时间内使白蚁死亡，但是，由于使白蚁死亡的有效物质（光、电、热、射线等）均要直接作用到白蚁，才能使白蚁死亡，致死物在蚁群中不能增值传染，不能依靠白蚁间相互感染消灭整个蚁群。

因而，物理防治较适宜于局部处理，不能广泛应用于白蚁防治，难以达到长久有效的要求。

1.4.2化学防治法

化学防治因其毒杀效果好，驱避强烈，所以仍然是目前最主要、最普遍研究的白蚁防治方法。

在防治过程中一般是利用化学防治剂的触杀、胃毒、熏蒸等作用来歼灭白蚁。

目前常用的白蚁防治方法主要有：

粉剂毒杀法，泼浇法，毒饵诱杀法，熏蒸法等.药剂的毒力是化学防治的核心，在防治过程中，药剂无增值作用。

而高效低毒对化学防治来讲，是一项难以克服的矛盾。

现在的化学防治研究，也只能提高药剂的利用率，降低防治工作的损耗量，无法避免使用毒剂，只能使实际用药量尽可能接近防治所需的最小用药量。

目前我国及各国市场上常用的白蚁防治剂主要有：

砷制剂、金属盐类、无机酸类、有机氯（氟）类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、硅烷类、有机杂环类和昆虫生长调节剂等。

砷制剂是无机白蚁防治剂的重要品种，主要品种如亚砷酸（As2O3）、砷酸铅、亚砷酸钠等。

亚砷酸俗称砒霜，是一种强胃毒剂。

利用白蚁的互相吮舐习性，还可制成各种诱杀剂使用。

该药是我国目前使用量最大的灭蚁剂，但在潮湿环境下灭蚁效果不佳。

目前，随着人们环保意识的加强，逐渐被淘汰。

有机氯（氟）药剂其主要品种如氯丹（chlordane）等。

氯丹的触杀、胃毒、熏蒸作用强烈，且残效期长，广泛用于新建房屋的白蚁预防，是我国过去使用量最大的白蚁预防药剂。

但是，由于这些药物的强残留作用和高汽化性，我国现在已经停止生产并禁止使用。

硫酰氟（sulfurylfluoride）和溴甲烷是目前我国被允许使用的2种熏蒸剂，但溴甲烷在发达国家已于2005年被禁止使用，发展中国家则需在2015年完全淘汰。

有机磷类代表为毒死蜱（chlorpyrifos），是一种有机磷类高效白蚁防治剂。

触杀、胃毒和熏蒸作用强烈，而且长效、广谱、低残留。

毒死蜱是国内目前最有可能替代氯丹的较理想药剂，也是目前国外使用最多的白蚁预防药剂。

此外，拟除虫菊酯类药剂是目前世界上品种最多的白蚁预防药剂，以氯菊酯（permethrin）、氯氰菊酯（cypermethrin）、氰戊菊酯（fenvalerate）等菊酯类为有效成分为代表的白蚁防治剂，已在美国甚至全世界都占有较大的市场比例[19]。

昆虫生长调节剂被誉为“第3代杀虫剂”，主要包括保幼激素类似物和几丁质合成抑制剂两大类。

氟铃脲对环境污染小，胃毒作用和触杀作用明显，对北美散白蚁、白湾乳白蚁的控制作用显著[19]。

1.4.3