质粒DNA的提取与酶切Word文档格式.docx

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溶液II：

0.2NNaOH、1%SDS；

（临用前混合）

溶液III：

3M醋酸钾、2M醋酸。

1、溶液I的作用：

对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。

加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。

EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。

此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。

2、溶液II的作用：

NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。

这一步操作要注意两点：

第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；

第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

3、溶液III的作用：

SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。

溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。

同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。

2M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。

基因组DNA一旦发生断裂，小于100kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。

这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。

4、酚/氯仿/异戊醇的作用：

PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。

加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。

还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。

而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。

二试剂准备

1SolutionI：

（100ml）

50mM葡萄糖

25mMTris-HCl（PH8.0）

10mMEDTA

10mg/100mlRNaseA

2SolutionII：

0.2NNaOH

1%SDS

3SolutionIII:

（100ml）（PH5.5）

3MKAc

2MHAc

4酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）

570%乙醇100ml

6LB/amp培养基200ml（前一次实验已准备）

三实验步骤

1接种（实验前一晚进行）

挑取单克隆，接种到LB（Ampr或Kan）液体培养基中，37°

C，220r/min，O/N；

2质粒提取

吸取1ml菌液于Eppendorf管中，8000r/min离心3min，弃尽上清。

加入150μl冰预冷的solutionI，涡旋振荡30s后置于冰上3min；

加入300μlsolutionII，快速上下颠倒试管4-5次，置于冰上3-5min；

再加入225μl冰预冷的solutionIII，上下小心颠倒5-6次，置于冰上3-5min；

12000r/min离心5min。

取上清（约600μl），加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:

1），混匀；

取上清（约500μl），加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20°

C静置2h或O/N；

12000r/min离心5min，去上清，沉淀用400μl冰预冷70%乙醇洗2-3次，吹干沉淀；

加入15μl含0.5URNAase的ddH2O溶解沉淀，37°

C静置30min，-20°

C保存。

质粒酶切：

向提含有质粒的小管中加入20ul酶切体系：

质粒8ul

ECOR11ul

H2O8ul

KPN11ul

10XBuffer2ul

轻轻混匀，置于37度水浴1h,终止反应。

电泳：

酶切产物电泳，直接取5ul加入点样孔（是否加入loadingbuffer与反应加入试剂有关）；

质粒电泳需要加入loadingbuffer混匀后加入点样孔。

3电泳检测质粒提取结果

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。

碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。

其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

电泳处理结果如下：

四结果分析：

电泳图中左数5~8条带为二组实验结果，其中5，7条带为酶切电泳，6，8条带为质粒电泳结果。

酶切结果，将质粒分为1000bp左右的单链DNA和2000bp左右的开链环质粒，所以开链环状质粒电泳速度<

单链DNA；

而质粒电泳结果显示清晰的一条带，说明质粒提取结果不错。