高二生物校本教材《植物组织培养技术》.docx

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高二生物校本教材《植物组织培养技术》

校本课程开发方案

植物组织培养技术

绪论

教学目的与要求

   1．掌握组织培养的概念和培养的类型

   2．掌握组织培养的特点

   3．一般掌握组织培养发展历史

   4．初步掌握组织培养在农业实践上的应用

教学重点与难点

   植物组织培养的概念；植物组织培养技术和理论基础

一、组织培养的概念

    高等植物的组织培养（tissue culture）技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。

通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分（即外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。



二、组织培养的类型

   组织培养按培养对象可分为：

  1.植株培养（plant culture）　

  2.器官培养（organ culture）　

  3.组织或愈伤组织培养（tissue or callus culture）　

    为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。

  4.细胞培养 （cell culture ）

  5.原生质体培养（proplast culture ） 　

是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。

三、植物组织培养的基本理论

（一）植物细胞的全能性

    植物组织培养的理论依据是细胞全能性。

    所谓细胞全能性就是指植物体的任何一个有完整细胞核的活细胞都具有该种植物的全套遗传信息和发育成完整植株的潜在能力。

   植物细胞的全能性是潜在的，要实现植物细胞的全能性，必须具备一定的条件：

  ①体细胞与完整植株分离，脱离完整植株的控制；

  ②创造理想的适于细胞生长和分化的环境，包括营养、激素、光、温、气、湿等因子。

（二）植物的再生性

    在植物分化根、茎、叶等器官的过程中，某处组织受到一定的损伤，则在受伤部位往往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，从而形成新的完整植株。

    脱分化：

是指成熟细胞或已分化的细胞转变成为分生状态的过程，即诱导成为愈伤组织的过程。

   愈伤组织：

是指在人工培养基上经诱导后外植体表面上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

   再分化：

是指由脱分化的组织或细胞转变为各种不同的细胞类型，由无结构和特定功能的细胞团转变为有结构和特定功能的组织和器官，最终再生成完整植株的过程。

（三）根芽激素理论

     根和芽的分根和芽的分化由生长素和细胞分裂素的比值所决定，二者比值高时促进生根；比值低时促进茎芽的分化；比值适中则组织倾向于以一种无结构的方式生长。

通过改变培养基中这两类激素的相对浓度可以控制器官的分化。

（四）组培苗遗传稳定性的问题

  1、影响组培苗遗传稳定性的因素

（1）基因型

（2）继代次数与继代时间

（3）发生方式

（4）外源激素

  2、减少变异，提高遗传稳定性的措施

四、植物组织培养的发展与应用

（一）植物组织培养的发展

（二）植物组织培养的技术特点

  1、培养材料经济

  2、培养条件可以人为控制 

  3、生长周期短，繁殖率高 

  4、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制

（三）植物组织培养的应用

  1.种苗快速繁殖

  2.苗木脱毒

  3.培育新品种

  4.保存和交换植物种质资源

  5.生产植物性药物和生物制品

本章小结

  1．植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植株的过程。

  2．按照外植体的不同，植物组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。

  3．组织培养具有：

培养条件可以人为控制；生长周期短；繁殖率高；管理方便；利于工厂化生产的特点。

因而发展迅速。

  4．植物组织培养技术在农业生产上的应用主要体现在：

快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；植物育种；工厂化育苗等。

第一章培养条件与设计要求

教学目的与要求

    掌握满足植物组织培养前提条件的方法；能够说出植物组织培养中所需要的环境条件，了解实验室的设计要求

教学重点与难点

    无菌操作；培养的环境条件

第一节无菌条件

    在植物组织培养的概念中我们提到必须在“在无菌的条件下”，无菌是进行植物组织培养的前提条件，它贯穿植物组织培养的始终。

而自然界中又常常伴随着大量的杂菌，因此，灭菌和无菌操作成为组织培养的常规工作之一。

在此我们要了解一些灭菌的方法以及如何针对不同的灭菌对象选择相应的方法，做到在植物组织培养过程中进行无菌操作，提高成功率，减少浪费。

一、基本概念

1、有菌与无菌的范畴

    有菌的范畴是指凡是暴露在空气中和接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的；而无菌的范畴是指经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，或经其他理化灭菌方法（并证明是有效的）处理后的物体，高层大气、岩石内部，健康动植物体内不与外界接触的组织内部、强酸强碱、灭菌剂表面及内部等都是无菌的。

由此可见，地球表面无菌空间比有菌空间小得多。

这里所说的菌是指细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物。

2、灭菌与消毒

    所谓灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有有生命的物质全部杀死；而消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。

由此可见，灭菌与消毒的主要区别在于前者杀菌强烈，能杀死所有活细胞；后者作用缓和，主要杀死或抑制附在植物材料表面的微生物，但芽胞、厚垣孢子一般不会死亡。

但是，灭菌与消毒是相对的，如果消毒时间过长或消毒剂浓度过高，也可杀死全部活的细胞，消毒就成为灭菌了。

反之，灭菌剂只能起到消毒作用。

二、灭菌方法

（一）物理灭菌

1、高压湿热灭菌

    主要用于培养基、接种工具、无菌水等的灭菌，培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。

    高压湿热灭菌的原理：

在高温高压的条件下，维持一定的时间,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

一般是压力为0.11 -0.15MP，温度为121-123℃，维持15-20分钟可以达到有效灭菌的目的。

影响湿热灭菌效果的因素有以下几方面：

①灭菌器内冷空气排出的程度  

②灭菌物品的数量、包装和放置  

③加热速度 

④ 超高热蒸汽  

2、干热灭菌

    灼烧灭菌主要用于无菌接种的器械。

无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

冷却后立即使用。

    干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。

通常采用170℃持续90min来灭菌。

3、过滤灭菌

    过滤灭菌主要用于不耐热的物质如赤霉素、玉米素和某些维生素的灭菌。

其过滤原理是通过直径为0.45μm以下的微孔滤膜使溶液中的细菌和真菌的孢子等因大于滤膜直径而无法通过滤膜，从而达到灭菌的效果。

4、紫外线灭菌

    主要用于接种室、缓冲间、超净工作台或接种箱的空间灭菌。

原理：

利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，导致死亡。

但是由于紫外线的穿透力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。

（二）化学灭菌

    化学灭菌是指利用化学物质杀灭、抑制微生物的方法。

这种物质称为灭菌剂（有时也称为消毒剂）。

按其作用水平，可分为灭菌剂（即高效消毒剂）、中效消毒剂、低效消毒剂、防腐剂和保藏剂。

` 1、熏蒸灭菌 

常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8m1／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g／m3高锰酸钾氧化挥发。

熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。

冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。

  2、喷雾灭菌

    一些物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。

如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％-2％的来苏儿溶液以及0.25％-1％的新洁尔灭也可以。

  3、植物材料表面用消毒剂灭菌

三、无菌操作

    外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织或细胞转入到无菌培养基上的过程。

由于整个过程都是在无菌条件下进行的，所以又称为无菌操作。

第二节培养条件

一、温度（temperature）

    大多数植物组织培养 都是在23-27、之间进行，一般采用25土2℃。

低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35、时对植物生长不利。

二、光照（1ight）

  1．光照强度（1ight intensity）

  2．光质（light wave）

  3．光周期（1igh period）

三、湿度（humidity）

    一般要求70％-80％的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。

四、渗透压（penetrating pressure）

    通常1-2个大气压对植物生长有促进作用。

五、pH值

   不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要

六、气体（gas）

第三节 实验室与育苗工厂的硬件要求

 一、设计原则与总体要求

（一）设计原则

  1、防止污染。

控制住污染，就等于组织培养成功了一半。

  2、按照工艺流程科学设计，结构和布局合理，节能、安全,便于操作，利于提高生产效率。

  3、根据培养目的和规模来设计。

其规模大小根据市场需求、年预期产苗量、投资额、现有条件等因素综合确定，体现适用性。

  4、对于家庭组培室要因地制宜，简化程序，因陋就简。

（二）总体要求

  1、选址要求避开污染源。

  2、室内装修做到六面光亮

  3、各分室的大小、比例要合理。

  4、接种室、培养室从严要求

  5、充分利用自然温光资源

二、实验室的基本组成

    一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、配制室、灭菌室、缓冲间、接种室、培养室、观察室、驯化棚室等。

在设计时结合具体情况，可以合并部分分室。

（一）洗涤室

  1、主要功能　用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。

  2、设计要求　根据工作量的大小决定其大小，一般10m2左右。

要求房间宽敞明亮，方便多人同时工作；有电源、自来水和水槽（池），上下水道畅通；地面耐湿、防滑、排水良好，便于清洁。

  3、仪器与用具配置　工作台、烘箱、晾干架、周转筐（塑料或铁制）、各种规格的毛刷、药品柜等。

（二）培养基配制室

  1、主要功能　培养基的配制、植物材料的预处理。

  2、设计要求　要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽（池），保证上下水道畅通。

  3、仪器与用具配置　

（三）灭菌室

  1、主要功能　用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。

  2、设计要求　要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。

  3、仪器与用具配置　压力灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。

（四）缓冲间

  1、主要功能　防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌。

接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。

  2、设计要求  要求空间洁净，墙壁光滑平整，地面平坦无缝，并在缓冲间和接种室之间用玻璃隔离，配置平滑门，以便于观察、参观和减少开关门时的空气扰动。

  3、仪器与用具配置　紫外光灯、小洗手池、搁架、鞋架、衣帽钩、拖鞋、工作服、实验帽和口罩等。

（五）接种室

  1、主要功能　进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。

其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。

  2、设计要求　要求密闭、干爽安静、清洁明亮；塑钢板或防菌漆的天花板、塑钢板或白瓷砖的墙面光滑平整，不易积染灰尘；水磨石或水泥地面平坦无缝，便于清洗和灭菌。

  3、仪器与用具配置　超净工作台、空调机等

（六）培养室

  1、主要功能　培养离体材料。

  2、设计要求　

  3、仪器与用具配置　

（七）观察室

（八）驯化棚室

  1、主要功能　进行组培苗的驯化移栽。

  2、设计要求　组培苗的驯化移栽通常在温室或塑料大棚内进行。

  3、仪器与用具配置　

  参观学校的组培室

三、组培育苗工厂的基本组成

    育苗工厂应包括组培苗生产车间和驯化栽培区。

其中组培苗生产车间主要包括洗涤车间、培养基配制车间、灭菌车间、接种车间、培养车间；驯化栽培区包括移栽驯化车间和育苗苗圃，可以单独设置。

此外，还有办公室、值班室、仓库、会议（培训）室、冷藏室、产品展示厅等附属用房。

四、家庭组培室的基本组成

    根据组培苗生产的基本需要及房间的数量、面积大小，合理确定家庭组培室的基本组成。

如果房间较多、面积较大，家庭组培室设计准备室、接种室和培养室；如果房间较少，接种室可与培养室合而为一，也可以用简易接种箱代替接种室，准备室可与厨房或餐厅通用。

也可以将面积较大的房间间隔为上述具有不同功能的空间。

本章小结

    温度、光照、氧气、PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。

第二章培养基

教学目的与要求

     一般掌握培养基的种类、特点和各自的作用

教学重点与难点

    培养基的成分与作用；主要培养基的特点；母液的配制与培养基的制作

第一节培养基的成份与种类

    培养基是提供植物生长发育所需各种养分的介质。

在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。

因此，理解培养基的组成及其作用，掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。

一、培养基的成份

（一）水分

（二）无机盐

1.大量元素

   大量元素是指植物生长发育所需的浓度大于0.5 mmol/L的营养元素，主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。

2.微量元素

   微量元素是指植物生长发育所需的浓度小于0.5 mmol/L的营养元素，主要有Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B等。

 （三）有机化合物

1.糖类

    糖类提供外植体生长发育所需的碳源、能量，使培养基维持一定的渗透压。

蔗糖是最常用的糖类，可支持许多植物材料良好生长。

其使用浓度一般为2%～5％，常用3％，但在胚培养时可高达15％，因蔗糖对胚状体的发育起着重要作用。

在大规模生产时，可用食用白糖代替，以降低生产成本。

2.维生素类

   完整植株在生长过程中能自身合成各种维生素，可满足自身各种代谢活动的需要。

但在离体培养中则不能合成足够的维生素，需要另加一至数种维生素，才能维持正常生长。

常用的维生素有VB1、VB6、VPP、VC等。

3.肌醇

4.氨基酸

   氨基酸是良好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用，在培养基中含有无机氮的情况下，更能发挥其作用。

5.天然有机复合物

  常用的天然有机复合物有椰乳、香蕉泥、马铃薯提取物、酵母提取液、苹果汁、番茄汁等。

（四）植物激素

   植物激素是培养基的关键性物质，对植物组织培养起着决定性的作用。

1.生长素类

①种类与活性强弱  常用的有IAA、IBA、NAA、2，4-D，其活性强弱为2，4-D>NAA>IBA>IAA，一般它们的活性比为：

IAA∶NAA∶2，4-D = 1∶10∶100。

②作用

  诱导愈伤组织形成; 促进根的生长; 协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长。

③稳定性和溶解性  除了IAA不耐热和光，易受到植物体内酶的分解外，其他生长素激素对热和光均稳定。

   生长素类溶于酒精、丙酮等有机溶剂。

在配制母液时多用95%酒精或稀NaOH溶液助溶。

一般配成0.1mg/ml～0.5mg/ml的母液贮于冰箱中备用。

2.赤霉素（GA）

①作用  

    主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。

赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质化，比值低时有利于韧皮化。

另外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。

一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。

②稳定性和溶解性  赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95%酒精助溶。

它与IAA一样不耐热，需在低温条件下保存，使用时采用过滤灭菌法加入。

如果高温高压灭菌赤霉素将有70～100%失效。

3.细胞分裂素类

①种类及活性强弱  这类激素是腺嘌呤的衍生物，常见的有6-BA、KT、ZT、2-ip等。

其活性强弱为2-ip > ZT > 6-BA > KT。

②作用

    抑制顶端优势，促进侧芽的生长；诱导愈伤组织或器官分化出不定芽；促进细胞分裂与扩大，延缓衰老；抑制根的分化。

③稳定性与溶解性  

    细胞分裂素能溶解于稀酸和稀碱中，在配制时常用稀HCl助溶。

 （五）培养物的支持材料

1.琼脂

  琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供给培养物任何营养。

它是固体培养时最好的固化剂。

2.其它

（六）活性炭

   加入活性炭的目的主要是利用其吸附性，减少一些有害物质的不利影响，如能够吸附一些酚类物质，可减轻组织的褐化（在兰花组培中作用效果明显）。

此外，创造暗环境，有利于某些植物的生根。

（七）抗生素

   抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等。

三、培养基的种类与特点

（一）培养基的种类

  虽然培养基的种类名称很多，但只要抓住划分的依据就容易理解和记忆。

1、根据态相不同，培养基可分为固体培养基与液体培养基。

2、根据培养阶段不同，可分为初代培养基、继代培养基。

3、根据培养进程和培养基的作用不同，培养基分为诱导（启动）培养基、增殖（扩繁）培养基及壮苗生根培养基。

4、根据其营养水平不同，分为基本培养基和完全培养基。

   基本培养基即平常所说的培养基，如MS、White培养基。

   完全培养基由基本培养基和添加适宜的激素和有机附加物组成。

   对培养基的某些成分进行改良而成的培养基称为改良培养基。

（二）常用培养基的特点 

第二节 培养基的制作

一、母液的配制

   在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。

为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。

所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。

一般母液配成比所需浓度高10-100倍。

母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。

    下面以MS培养基制备为例，概述其制备方法。

（1）大量元素母液可配成浓度10倍母液。

用分析天平按配方称取药品，分别加100ml左右蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。

注意Ca2+和阳Po43-易发生沉淀。

然后倒人1000ml定容瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。

（2）微量元素母液 可配成浓度配成比100倍的母液。

用分析天平按表准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000ml。

    （3）铁盐母液 可配成100倍的母液，按表称取药品，可加热溶解，混合后加水定容至1000ml。

    （4）有机物母液 可配成500倍的母液。

按表分别称取药品，溶解，混合后加水定容至500ml。

    （5）激素母液的配制

    每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mg／ml。

用时根据需要取用。

因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。

另外，多数激素难溶于水，要先溶于可溶物质，然后才能加水定容。

    它们的的配法如下：

    将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95％的酒精中。

再加水定容-定浓度。

NAA可先溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定容到一定浓度。

2，4-D可用少量1mol NaOH溶解后，再加水定容到一定浓度。

将Kt和BA先溶于少量1mol的HCI中再加水定容。

将玉米素先溶于少量95％的酒精中，再加热水到一定浓度。

配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。

二、培养基的配制（融入实验）

三、培养基的分装与灭菌（融入实验）

第三节 培养基的筛选

一、试验前的准备工作

1.文献检索

  查找文献的途径主要有：

  ①专业杂志或有关杂志上查阅；

  ②互联网上查找

  ③报纸或电视等媒体上获取。

2.参观咨询

二、预备试验

   所谓预备试验就是指正式试验开始之前根据试验设计进行的过渡试验，为正式试验的开展所做的前期摸索。

三、常用的试验方法

1.单因子试验  

    单因子试验是指整个试验中保证其他因素不变，只比较一个试验因素的不同水平的试验。

2.双因子试验

   双因子试验是指在整个试验中其他因素不变，只比较两个试验因素的不同水平的试验。

3.多因子试验

4.逐步添加和逐步排除的试验方法

本章小结

1．培养基多以命名人的名字命名。

目前，比较流行的培养基有：

MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；B5培养基，其特点是含有较低的铵；White培养基，其特点是无机盐低，适于生根；N6培养基，其特点是KNO3和（NH4）2SO4含量较高，适于花药培养；KM－8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。

2．水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。

这五种成分有各自的作用效果和要求。

3．配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。

即先配成大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；铁盐100倍液，定容至1000ml；维生素1mg∕l，定容至100ml；激素1mg∕l，定容至50～100ml。

4．培养基分装到100ml的三角瓶，用量一般为每瓶30～40ml，过多造成浪费，过少则不利于植物的生长；高压灭菌时，压力通常为0。

10Mpa，20分钟。

5．筛选合适的培养基一般有四种方法，即单因子试验法、多因子试验法、逐步添加和排除法以及广谱实验法。

其中，第一种方法比较简单，第二种方法比较准确，而后两种方法则比较复杂。

第三章植物组织培养一般程序

教学目的与要求：

    掌握植物组织培养的一般程序；掌握外植体选择的原则与处理方法；掌握增殖培养和生根的方法；掌握植物组织培养过程的问题及解决办法。

教学重点与难点：

    植株再生的途径；增殖与生根的方法；三大难题的解决措施

    植物组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节。

第一节启动培养

   初代培养是指在组培过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段，即无菌接种完成后，外植体在适宜的光、温、气等条件下被诱导成无菌短枝（或称茎梢）、不定芽（丛生芽）、胚状体或原球茎的过程。

因此，也称为诱导培养。

由于外植体的来源复杂，又携带较多杂菌，因此初代培养一般比较困难。

一、外植体的选择与处理

    植物组织培养的成败除与培养基、培养条件的正确选择有关外，另一个重要因素就是