血清尿素的测定Word文件下载.docx

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标准管

测定管

血清

－

0.02

尿素标准应用液

去离子水

二乙酰一肟溶液

0.5

酸性试剂

5.0

混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。

【计算】

【参考范围】血清尿素1.78～7.14mmol/L。

【临床意义】

1．血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。

（1）生理因素：

高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。

血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。

成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。

（2）病理因素

1）肾前性：

最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加。

2）肾性：

肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。

3）肾后性疾病：

所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。

2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。

【注意事项】

1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，（每小时小于5%）。

煮沸显色经冷却后，应及时比色。

2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。

3．尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮（1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮）；

另外还有以尿素氮mmol/L表示，则1mmol/L尿素＝2mmol/L尿素氮。

世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。

【评价】

1．本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。

在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。

若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。

2．线性上限仅达7.14mmol/L；

回收率为96%～102.1%。

3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。

很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。

另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。

胆红素达171μmol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。

实验80脲酶－波氏比色法测定血清尿素

【原理】脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。

蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长处有吸收峰。

1．酚显色剂苯酚10g，亚硝基铁氰化钠（含2分子水）0.05g，溶于1L无氨去离子水中，存放4℃可保存2个月。

2．碱性次氯酸钠溶液氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml（相当于次氯酸钠0.42g），再加无氨去离子水至1L，置棕色瓶内，4℃可保存2个月。

3．脲酶贮存液脲酶（比活性3000～4000U/g）0.2g置于20ml50%（V/V）甘油中，4℃可保存6个月。

4．脲酶应用液脲酶贮存液1ml，加10g/LEDTA-Na2溶液（pH6.5）至100ml，4℃保存可稳定1个月。

5．尿素标准液（5.0mmol/L）见二乙酰一肟法。

【操作步骤】

按表13-2操作。

表13-2脲酶-波氏比色法操作步骤

加入物（ml）

脲酶应用液

1.0

血清

0.01

—

尿素标准液

无氨去离子水

混匀，37℃水浴15min

酚显色剂

碱性次氯酸钠

混匀，置37℃水浴20min。

波长630nm，空白管调零，读取吸光度。

【计算】

【参考范围】同二乙酰一肟法（实验79）。

1．本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1000多倍，因而测定尿氨时，氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。

2．空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。

高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。

1．呈色稳定性在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.01～0.02。

2．本法批内CV＜1.8%，批间CV＜2.7%；

回收率96.71%～103.35%；

与酶偶联法对照测定病人标本37例，相关系数（r）为0.972；

线性范围较宽，达17.58mmol/L。

3．大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。

酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L；

去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。

胆红素在34.2μmol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.65～68.4μmol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。

实验81酶偶联速率法测定血清尿素

【原理】尿素经脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶Ⅰ作用生成谷氨酸与氧化型辅酶Ⅰ。

还原型辅酶Ⅰ在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。

其反应式如下：

1．酶试剂试剂成分和在反应液中的参考浓度如下：

pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液150mmol/L

脲酶8000U/L

谷氨酸脱氢酶（GLDH）700U/L

还原型辅酶Ⅰ（NADH）0.3mmol/L

α-酮戊二酸15mmol/L

ADP1.5mmol/L

目前较多采用双试剂法，脲酶和NADH单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同方法，使试剂有效期有所不同。

2．尿素标准液（5.0mmol/L）见二乙酰一肟法（实验79）。

按表13-3操作。

表13-3酶偶联速率法操作步骤

0.015

酶试剂

1.5

混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化（ΔA/min）。

测定参数温度37℃，波长340nm，平衡时间30s，读数时间30s，样品/反应总体积为1∶101。

本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。

1．在340nm试剂空白对水的吸光度应大于1.00A，试剂浑浊或吸光度低于1.00A的应放弃使用。

2．测定过程中，各种器材和去离子水均应无氨离子污染，防止交叉污染，否则结果偏高。

3．血液标本最好用血清，含NaF的血浆可导致结果偏低。

4．在内源性氨正常时，本法能用于测定尿中的尿素。

因为在反应的最初几秒种内内源性氨会很快被耗尽，随后在340nm测定的是由脲酶催化尿素反应生成的氨所引起的吸光度。

1．本法批内CV0.78%，批间CV2.94%；

回收率93.0%～105.3%，线性上限为17.85mmol/L。

2．血红蛋白对测定有一定的干扰，应避免标本溶血。

在自动分析仪中测定，因标本被大量稀释，故不受其它含氮化合物、胆红素、血红蛋白及高血脂的干扰。

第二节血清肌酐测定

肌酐的检测目前多用的仍然是碱性苦味酸比色法，手工分析需去除蛋白后再测定，以避免假肌酐干扰；

自动化分析则用碱性苦味酸速率法或两点法即能避开假肌酐影响。

近几年发展了酶法，如肌酐酰胺水解酶法、肌酐亚氨水解酶法等，但在临床上应用尚少。

实验82去蛋白碱性苦味酸法测定血清肌酐

【原理】血浆或血清标本经除蛋白处理后，肌酐与碱性苦味酸产生Jaffé

反应，生成橙红色的苦味酸肌酐复合物，在510nm和520nm间测定吸光度，与肌酐含量成正比。

尿液标本可稀释后直接测定。

1．35mmol/L钨酸溶液

（1）100ml去离子水中，加入1g聚乙烯醇，加热助溶（勿煮沸），冷却。

（2）300ml去离子水中，加入11.1g钨酸钠（Na2WO42H2O,Mw329.81），使完全溶解；

（3）300ml去离子水中，慢慢加入2.1ml浓硫酸，冷却。

于1L容量瓶中，将

（1）液加入

（2）液中，再与（3）液混匀，加去离子水至刻度，室温稳定1年。

2．0.04mol/L苦味酸溶液苦味酸（Mw229.104）9.3g，溶于500ml80℃去离子水中，冷却至室温，加去离子水至1L。

用0.1mol/L氢氧化钠滴定，以酚酞作指示剂。

根据滴定结果，用去离子水定容至0.04mmol/L。

0.04mol/L氢氧化钠1ml相当于0.04mmol/L苦味酸1ml（9.1644mg）。

3．0.75mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠30g，加去离子水使其溶解，冷却后用去离子水定容至1L。

4．肌酐标准贮存液（10mmol/L）113mg肌酐（Mw113.12）用0.1mol/L盐酸溶解，并移入100ml容量瓶内，再用0.1mol/L盐酸定容至刻度。

5．肌酐标准应用液（100μmol/L）取1ml肌酐标准贮存液，用0.1mol/L盐酸稀释至100ml。

1．取血清（或血浆）0.5ml，加入35mmol/L钨酸溶液4.5ml，充分混匀，静置5min，3000r/min离心10min，取上清液；

若为尿液标本用去离子水作1∶200稀释。

2．按表13-4操作。

表13-4去蛋白碱性苦味酸法操作步骤

血清无蛋白滤液（或1∶200稀释尿液）

3.0

肌酐标准应用液

苦味酸溶液

氢氧化钠溶液

混匀后室温15min，波长510nm，空白管调零，读取各管吸光度。

【参考范围】男性：

44～133μmol/L；

女性：

70～106μmol/L

【临床意义】血液肌酐经肾小球过滤，肾小管既不重吸收，也不分泌，即肾脏对肌酐的排泄能力强，因而肾脏疾病早期血浆肌酐通常不高，在反映肾小球滤过率下降方面，血肌酐比血尿素的灵敏度低。

但血肌酐受饮食、运动、激素、蛋白质代谢等因素的影响较少，所以诊断特异性比血尿素好。

【注意事项】

1．据报道碱性肌酐苦味酸复合物的最大吸光度在485nm，过量苦味酸离子存在于反应液中，在波长低于500nm时会产生明显的吸收。

2．反应温度以15～25℃为宜，10℃以下，会抑制Jaffe反应。

温度升高，可使碱性苦味酸溶液显色增深，但测定管较标准管更为明显。

3．呈色后标准管色泽较稳定，但测定管吸光度随时间延长而增加，可能与血标本中存在的非特异性物质有关，故在加显色剂后30min内比色为宜。

4．苦味酸一定要纯，否则需纯化。

若含有杂质，则使试剂空白吸光度增加而影响测定结果。

1．特异性血浆中的蛋白质和糖、丙酮、维生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等均能与碱性苦味酸发生非特异性反应，反应速率稍慢。

红细胞中这类物质最多，约有60%，血浆或血清约20%，尿液约5%。

故血清和血浆需制备无蛋白滤液后测定。

2．回收率受无蛋白滤液的pH影响，滤液pH在3～4.5时，回收率为85%～90%，pH在2以下时，回收率为100%。

3．线性范围肌酐含量在1320μmoL/L以内线性良好。

实验83不去蛋白速率法测定血清肌酐

【原理】根据肌酐与苦味酸反应生成桔红色苦味酸肌酐复合物的速度与假肌酐不同，而设置适宜的检测时间。

一些假肌酐如乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应，而在20～80s之间，肌酐反应占绝对优势，80s后其它多数干扰物才有较快的反应，故而选择25～60s的反应速率来反映真肌酐的含量。

1．0.04mol/L苦味酸溶液。

2．0.32mol/L氢氧化钠溶液。

3．碱性苦味酸溶液根据用量，将0.04mol/L苦味酸和0.32mol/L氢氧化钠等体积混合，可加适量表面活性剂如TritonX-100，放置20min以后即可应用。

4．肌酐标准液同除蛋白碱性苦味酸法。

【操作步骤】采用自动/半自动分析仪速率法检测，按试剂盒说明书操作，或参照以下参数分析：

仪器波长510nm，比色杯光径1.0cm，反应温度37℃，样品/反应体积＝1/11。

延迟时间20～30s，测量时间30s。

得到标准管ΔA/min和测定管ΔA/min。

53～97μmol/L；

44～80μmol/L

1．必须严格控制反应时间，以尽量避免快速或慢速反应假肌酐物质的干扰。

2．溶血产生的红细胞内非特异性物质将干扰反应。

3．胆红素可引起负偏差。

某些全自动生化分析仪，能设置空白速率参数，能去除胆红素负干扰。

1．特异性本法基本上可消除生理浓度的葡萄糖、维生素C和蛋白质等的干扰。

但乙酰乙酸＞500μmol/L、维生素C＞2840μmol/L、丙酮酸＞1140μmol/L时有明显的干扰。

高胆红素标本有明显的负干扰，溶血标本也有负干扰，标本应避免溶血。

2．回收试验96.7%～100.4%，平均98.5%。

3．线性范围肌酐在1768μmol/L范围内，线性良好。

实验84内生肌酐清除率测定

【原理】通过测定血和尿中肌酐含量来计算每分钟或24h有多少毫升或升血浆中的肌酐通过肾脏被清除，此值称为内生肌酐清除率。

肌酐清除率与个体的大小有关，可用体表面积来校正。

【操作步骤】试验前3天，嘱受检者禁食肉类，避免饮用咖啡或茶，停用利尿剂，避免剧烈运动。

适量饮水，使尿量不少于1ml/min。

收集24h尿样的同时，抽静脉血3ml。

同时测定血、尿肌酐含量。

内生肌酐清除率（L/24h）=

×

24h尿量（L）

内生肌酐清除率（ml/min）=L/24h×

校正后内生肌酐清除率（ml/min）=内生肌酐清除率×

体表面积可根据人体体表面积计算图查阅，见图13-1。

【参考范围】男：

105±

20ml/min

女：

95±

20ml/min

血浆肌酐浓度（SCr）反映肾小球滤过功能，与肾小球滤过率（GRF）共同用于慢性肾功能不全的分期：

第一期（肾功能不全代偿期）：

SCr133～177μmol/L；

GRF50～80ml/min。

第二期（肾功能不全失代偿期）：

SCr178～442μmol/L；

GRF50～20ml/min。

第三期（肾功能衰竭期）：

SCr443～707μmol/L；

GRF20～10ml/min。

第四期（尿毒症期）：

SCr≥707μmol/L；

GRF＜10ml/min。

1．最常见误差来源是尿液收集时间记录不准，或部分尿液丢失，因此要准确收集尿液。

要避免尿液在膀胱内潴留造成负误差，即要排空膀胱。

2．收集尿液期间避免作剧烈运动。

3．不同体表面积对结果影响很大，每个个体都应查图得出此值，参见图13-1。

图13-1人体体表面积计算图

第三节血清尿酸测定

尿酸测定方法可分为尿酸酶紫外法、尿酸酶－过氧化物酶偶联法及磷钨酸法三类。

其中以尿酸酶紫外法的分析性能最为优越，是尿酸测定的参考方法。

磷钨酸法先用血清或血浆制备无蛋白滤液再进行测定，方法繁琐，需手工测定，现在临床已较少应用。

自动化分析可用尿酸酶－过氧化物酶偶联法，无需做无蛋白滤液。

实验85磷钨酸还原法测定血清尿酸

【原理】去蛋白滤液中的尿酸在碱性溶液中被磷钨酸氧化生成尿囊素和二氧化碳，磷钨酸被还原为蓝色的钨蓝。

钨蓝的生成量与尿酸浓度成正比。

1．160mmol/L磷钨酸贮存液钨酸钠50g，溶解于去离子水400ml中，加浓磷酸40ml、玻璃珠数粒，回流2h，冷却至室温，用去离子水定容至1L。

置棕色瓶中保存。

2．16mmol/L磷钨酸应用液取磷钨酸贮存液10ml，用去离子水稀释至100ml。

3．0.3mol/L钨酸溶液钨酸钠（Na2WO4·

2H2O，Mw329.81）100g溶解于蒸馏水中，并定容至1L。

4．0.33mol/LH2SO4溶液于去离子水900ml中加入浓硫酸18.5ml,冷却后用去离子水定容至1L。

5．钨酸试剂于去离子水800ml中加入0.3mol/L钨酸溶液50ml、浓磷酸0.05ml、0.33moL/LH2SO450ml，混匀。

室温中可稳定数月。

6．0.99mol/LNaCO3溶液无水碳酸钠100g，溶于去离子水至1L。

置塑料试剂瓶中贮存，如有混浊可过滤后使用。

7．6.0mmoL/L尿酸标准贮存液在60℃溶解碳酸锂60mg于去离子水40ml中，加入尿酸（C5H4O3N4，Mw168.073）100.9mg，待溶解后冷却至室温，移入100ml容量瓶中，加入甲醛2ml，用去离子水定容。

棕色瓶中保存。

8．300μmol/L尿酸标准应用液取尿酸标准贮存液5.0ml、乙二醇33ml，用去离子水稀释至100ml。

【操作步骤】按表13-5操作。

表13-5磷钨酸还原法操作步骤

尿酸标准应用液

钨酸试剂

4.5

混匀，室温5min，3000r/min离心5min

空白管上清液

2.5

标准管上清液

测定管上清液

NaCO3溶液

混匀后静置10min

磷钨酸应用液

混匀，20min后，波长660nm处，空白管调零，读取各管吸光度。

血清尿酸（μmol/L）＝

【参考范围】男149～416μmol/L；

女89～357μmol/L。

【临床意义】尿酸测定主要用于各种原因引起的高尿酸血症，以及由此导致的痛风症。

1．原发性高尿酸血症

（1）原发性肾脏排泄尿酸减少，占原发性中80%～90%，为多基因性常染色体显性遗传所致。

（2）尿酸产生过多，以从头合成嘌呤过多占主要，占原发性10%～20%，也是多基因性常染色体显性遗传；

而特异性酶缺陷，如次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）部分缺乏或完全缺乏等，导致鸟嘌呤和次黄嘌呤不能经补救途径合成嘌呤核苷酸，而使尿酸产生过多者，仅占原发性1%。

2．继发性高尿酸血症

（1）尿酸排泄减少，为引起肾小球滤过减少和/或肾小管排泌尿酸减少的肾脏疾病所致。

（2）尿酸产生过多，见于骨髓增殖性疾病如各类白血病、多发性骨髓瘤、红细胞增多症，慢性溶血性贫血、全身扩散的癌症、恶性肿瘤化疗或放疗后和严重的剥脱性牛皮癣等。

【注意事项】

1．草酸钾与磷钨酸容易形成不溶性的磷钨酸钾，造成显色液混浊，因此不能用草酸钾作抗凝剂。

标本中尿酸在室温可稳定3d；

尿液标本冷藏后，可引起尿酸盐沉淀，此时调节pH至7.5～8.0，并将标本加热到50℃，待沉淀溶解后再进行测定。

2．尿酸在水中溶解度低（0.06g/L，37℃），但在碱性碳酸盐中易溶解，故配制标准液时可加入碳酸锂或碳酸钠助溶。

3．制备无蛋白滤液时，若滤液酸度过高，可引起尿酸与蛋白共沉淀，pH＜3时尿酸回收率明显降低，滤液pH为2.4～2.7，回收率仅为74%～97%；

滤液pH3.0～4.3，回收率为93%～103%。

1．特异性和干扰血液中许多非尿酸还原性物质，可造成尿酸假性增高。

如葡萄糖、谷胱甘肽、维生素C、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等能使结果偏高17.8～29.3μmol/L。

谷胱甘肽是血液中干扰最大的物质，当浓度为1.3mmol/L时可使尿酸增高41.65μmol/L。

谷胱甘肽主要存在于血细胞内，故以血浆或血清为标本时并无明显干扰。

蛋白质的巯基和酚羟基能使磷钨酸还原为蓝色，并产生混浊，故需制备无蛋白滤液。

2．准确度在沉淀蛋白前加入尿酸标准液，其回收率为96～102%。

标准液在150～600μmol/L范围内，测定值与真值的相关系数为0.9999。

3．精密度日内变异系数为1.2%～3.5%，日间变异系数为2.9%～4.4%。

4．线性范围在892.5μmol/L线性良好。

实验86尿酸酶-过氧化物酶偶联法测定血清尿酸

【原理】尿酸酶氧化尿酸，生成尿囊素和H2O2，在过氧化物酶催化下，H2O2使3，5二氯2-羟苯磺酸（DHBS）和4-氨基安替比林缩合成红色醌类化合物（Trinder反应），尿酸浓度与波长520nm吸光度成正比。

1．酶混合试剂

尿酸酶