植物细胞工程教案Word下载.docx
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1、概念:
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。
人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养
2、植物组织培养过程
离体的植物器官、组织或细胞---愈伤组织---根芽----植物体
脱分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。
再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。
植物组织培养一般分为以下几种
1、胚胎培养：
指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。
2、器官培养：
指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养
3、组织培养：
分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。
这是狭义的植物组织培养。
4、细胞培养：
指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。
5、原生质体培养：
指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养
三、植物再生途径
到底通过哪种途径再生，与试验材料和培养基尤其添加的激素有关
四、愈伤组织的种类
1、胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）:
表面光滑，组织结构紧凑，细胞小、再生能力强。
胚性愈伤组织容易形成体胚，所以称为胚性愈伤组织
2、非胚性愈伤组织：
表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。
一般，非胚性愈伤组织诱导率较高，可达到100％，即100％的外植体可以形成愈伤组织；
而胚性愈伤组织诱导率相对较低。
1、胚性愈伤组织的诱导
n花药，幼胚、茎尖培养容易形成胚性愈伤组织或直接形成胚状体，但茎、叶片、叶柄等外植体在适宜的培养基上也能形成胚性愈伤组织或胚状体。
胚性愈伤组织诱导培养基一般只加生长素，并以2，4－D效果最好。
但植物不同，或组织不同，添加的浓度差别很大。
如小麦幼胚培养适宜2，4－D浓度为2mg/L，甘薯茎尖培养为0。
2－2。
0mg/L，因品种不同而
2、体细胞胚的形成
n胚性愈伤组织形成后，有的在胚性愈伤组织诱导培养基上能直接形成体细胞胚，如花生及其野生种、小麦、甘薯的部分品种等不需要转培养基，可直接形成体细胞胚。
但还有些情况，必须将胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基上才能形成体胚。
据报道，脱落酸（ABA）有利于体胚形成，如甘薯，添加0。
5mg/L。
胚状体发育到一定阶段，容易与周围的细胞发生隔离，很容易从愈伤组织剥离下来。
这是因为胚状体周围有一层“边缘细胞层”，后来次层细胞退化解体，使胚状体与周围组织间形成间隙。
3、体细胞胚发芽及植株再生
将形成体细胞胚的愈伤组织带体胚转移到不含激素的培养基上后，体胚发育成成熟胚，并发芽，再生植株。
4、影响胚胎发生的因素
1）、生长调节物质（激素）对胚性愈伤组织的形成及体细胞胚胎发生影响最大的是激素。
胚性愈伤组织诱导，培养基中加入生长素类有效，尤其2，4－D。
但不同植物，或同一植物不同品种，对2，4－D浓度的要求不同。
一般添加0.5－2.0mg/L，但也有的植物浓度需要很高，如花生需要在10mg/L以上。
体胚的诱导，有的情况下可以在胚性愈伤组织上直接诱导出体胚，但也有的情况下，必须将胚性愈伤组织转移到体胚诱导培养基上才能形成体胚。
不同的植物，或同一植物不同品种，体胚诱导培养基不同。
有的在不加激素的培养基上有效；
有的需要加低浓度的生长素（0.01－0.1mg/L），有的加激动素（KT）或脱落酸（ABA
2）、氮源
n培养基中NH+4有利于体胚发生。
如加入0。
1MNH+4Cl可以促进胚状体的发育。
氨基酸、酰胺等有机酸也能促进体胚的发生。
柳乳、酵母提取液、水解酪蛋白等含有多种氨基酸，培养基中加入某一种有利于体胚发生。
n3）、植物基因型的影响：
不同植物，或同一植物不同品种（不同基因型）间胚性愈伤组织形成及体胚发生能力差别很大，并且所需挤塑剂浓度也不同
4）、植物的来源和年龄
n外植体不同体胚发生能力也不同。
一般，生长点、幼胚、花药、花粉等容易形成胚性愈伤组织和体胚。
n5）、其他因素培养温度、光照时间和强度等也会影响体胚发生一般，胚性愈伤组织诱导需要在黑暗下进行，待转到体胚诱导培养上后，可在光照下培养
5、以甘薯为例
n甘薯育苗取茎顶5厘米，去掉叶片----冲洗---超净工作台内表面杀菌显微镜下取茎
添加0。
2mg/LNAA，2mg/L6－BA，3％蔗糖，0。
8％琼脂的MS培养基（pH＝5。
8）上培养----1个月左右长出不定芽-----再生芽长至5cm以上，切下，并移植于MS基本培养基上----长大后，1－2个节间一段移植于新的MS基本培养基上，进行扩繁-----炼苗4天左右，移栽于趾石：
草炭土＝1：
1的基质中------成活后，移栽塑料棚，再扩繁----田间移栽。
六、愈伤组织诱导及植株再生
n
（一）、愈伤组织形成的过程外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。
1、诱导期：
即细胞分裂的准备期。
接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。
诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。
特点：
1.细胞的数目迅速增加。
如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。
2.每个细胞平均鲜重下降。
这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。
3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。
4．细胞的核和核仁增大到最大。
5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
6.随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快
总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：
细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态
3、形成期n从愈伤组织到器官发生形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。
进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织，称做分生组织结节。
分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。
由于此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。
（二）愈伤组织的继代培养：
脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。
这个过程叫做继代。
通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。
然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。
（三）愈伤组织的生长
•一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。
它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
•愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，有的很坚实，且这两类愈伤组织可互相转变。
其方法是：
加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆。
松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃的细胞分裂；
而不脆的愈伤组织很少分化，大都是高度液泡化的细胞。
脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团。
在培养中细胞产生迅速增殖，而坚实的愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而往往不能形成良好的悬浮系统
•愈伤组织的质地不同是由其内部结构上的差异所引起的。
坚实致密的愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织；
松脆愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排列毫无次序。
•生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；
老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
•外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；
花器脱分化较易，而茎叶较难；
幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。
•一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。
（四）愈伤组织的形态发生方式
•愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。
•形态建成：
外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。
•在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。
只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。
在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式
1．不定芽方式（unfixedbud）和根的发生
•不定芽和根的发生,是愈伤组织培养物或细胞培养物培养中常见的器官发生方式,分为三个不同的生长阶段:
首先,是细胞和离体植物体脱分化形成愈伤组织,这是外植体发生细胞发生分裂的结果.
•第二阶段为愈伤组织中形成一些分生细胞,形成瘤状结构,这是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的共同结果。
第三阶段为器官原基的形成，常由于在某些条件下，分生细胞团发生分化而形成不同的器官原基。
器官原基是由一个或一小团发生细胞经细胞分裂而形成，进而产生小块分生组织。
这些分生组织只有在一定条件下，才可逐渐转变到构成器官的纵轴上表现出单极性，从而分化为芽和根。
实验表明，在植物组织培养中，当外植体形成愈伤组织后，可以利用植物生长物质比例控制器官发生的模式，通过调整某些植物生长物质的比例促进芽和根的分化。
一般来说，生长素有利于愈伤组织的形成根，细胞分裂素可促进愈伤组织形成芽。
不定芽方式指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式
愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：
（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无芽的根或无根的芽；
（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出极而形成小植株，大多数植物属这种情况；
（3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。
这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物
（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。
•2．胚状体方式（somaticembryo）指由培养细胞诱导分化出的胚胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。
胚状体的发育过程：
细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
•具有以下三个特征:
•第一、具有两极性。
即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端与根端，而不定根或不定芽都为单向极性。
•第二、胚状体的维管组织与外植体的维管组植物解剖结构的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。
•第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形，而不定芽的维管组织无此现象。
（五）．愈伤组织形态发生的调控
•来源于不同植物或同一种植物不同部们的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，其遗传生理功能也可能或是具有胚性，或是不具胚性，在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个。
1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。
2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。
3）
旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。
4）经过长期继代保存而不丧失胚性，有便有可能对它们进行各种遗传操作。
细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。
1、材料本身
•1）．遗传型材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。
不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。
•2）．器官和部位通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。
但是对有些植物而言，确有明显差异。
如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。
•3）．年龄年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。
如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈入上部，苗的分化频率越高，苗分化频率越低。
因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。
2、培养基
培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。
1）．生长调节剂细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一，生长素对芽的抑制作用可为细胞分裂素所克服。
细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽形成；
而这一比例低时，有利于根的形成。
这样通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化
但是，要注意的是不同的生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。
如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。
2，4-D往往对生根不利，特别是在较高浓度下。
Kt和BA能广泛地诱导芽的形成，但BA比Kt的效力大。
玉米素的作用范围较窄，但对某些植物有特效。
因此，往往多数植物采用BA和Kt来诱导芽的形成。
2）．无机营养元素在植物组织培养中和整体植物一样，细胞的生长也要求满足植物生长的必要元素，若完全投入或过多或不足，也会影响细胞生长和分化。
不过其影响不如激素的影响明显。
但是各种类型的植物，器官所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White。
如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳；
而有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。
当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：
氮——某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色；
不能形成导管。
•氮钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退；
•硫——非常明显地褪绿。
铁——细胞分裂停止。
•硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。
•锰或钼——影响细胞伸长。
3）．有机成分在培养基中加了糖、各类B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。
各中氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可以促进器官分化。
其中酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官形成。
酰胺类往往有促进器官形成的作用。
水解酪蛋白中含有多种氨基酸，在进行器官分化培养时，加入一定量是有益的
4）物理性质培养基的物理性质（固体或液体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响。
在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形式，才能顺利地分化出苗。
•第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体培养基上进行培养；
•第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成；
第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培养基上进行培养。
•培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响，在花药培养中受到普遍的重视。
如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。
3、培养环境条件
1）．
光周期的影响光周期的需要与否，应根据植物种类培养目的来决定。
在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：
全暗、周期性光照、散射性光照，上述两种做法诱导率差异不大。
另一些植物差异较大，如石刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多。
大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较好；
光照对地钱干重的增加明显地优于黑暗培养。
器官发生阶段，一般给予周期性光照比较好。
光周期长短因植物种类而异。
多数植物8-10小时黑暗为宜。
如茄子、苹果等。
也有例外，有些植物如石刁柏需要16小时光照，12小时黑暗。
2、温度在组织培养中，一般都采用22-25℃的恒温条件下进行外植体的培养。
对一般植物来讲，都可较好地形成芽和根。
但是很多资料表明，温度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。
如对喜温性植物如茄科、葫芦科、兰科、禾本科等的培养温度一般可控制在26-28℃比较适宜。
而对于冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等植物则培养温度可控制在25℃以下较为适宜。
七、器官发生与体细胞胚胎发生
一．器官发生
（一）概念：
离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程
二）发生方式：
有两种发生方式
（1）直接发生：
（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。
（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
（2）间接发生：
外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
二胚状体方式（somaticembryo）指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株
1、由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1）外植体细胞脱分化。
外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。
这一阶段同不定芽方式一样
2）胚状体形成在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。
但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：
细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
•3）胚状体再发育成完整植株在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
2、胚状体与不定芽的区别
胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征
①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。
②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系
③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象
胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：
如胚状体产生伪数量比不定芽多；
胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；
胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。
这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的
八、以茎、叶片、叶柄等外植体为例
（一）、材料
可用试管苗（无菌苗或无毒苗，两者不同），也可从田间或温室取材，后者要表面杀菌
材料老嫩对植株再生影响很大，用幼嫩、生长旺盛的植株材料，可提高再生能力。
（二）、接种
茎叶柄一般切成5mm的段，叶片除去主脉和叶片的边缘，切成2×
2mm的小片，接种到培养基上。
（三）、培养
1、愈伤组织诱导培养基中一般添加生长素和细胞分裂素
生长素：
NAA、IAA、2，4－D、IBA
分裂素：
6－BA、Kinetin、Zeatin
因植物不同，添加生长素和分裂素的种类、浓度及配比不同
一般，生长素浓度相对高的情况下，有利于形成愈伤组织和不定根，而分裂素有利于不定芽的分化
2、不定芽在分化
有的植物，在适宜的诱导培养基上可以直接形成不定芽。
如丽格海堂，在添加NAA和6－BA的MS培养基上培养2－3周后，便形成不定芽，而在添加2，4－D和Kitentin的培养基上只能诱导出愈伤组织，而不能形成不定芽，必须转移到在分化培养基上才能分化不定芽。
再分化培养基以分裂素为主6－BA、Kitentin、Zeatin.也有报道GA3有利于不定芽分化。
还有的植物以不加激素为好
3、继代培养
继代培养的目的：
快速繁殖，促进再生可继代培养愈伤组织，也可继代培养再生植株，或诱导丛生芽
1）、愈伤组织继代培养
将形成的较大的愈伤组织，切分成小块进行培养，长大后在切分，待转移到再分化培养基上，可形成大量不定芽
2）、再生植株继代培养：
利用茎段腋芽大量繁殖
3）、诱导丛生芽：
利用带腋芽的茎段进行培养，在适宜的培养基上可诱导丛生芽，进行大量繁殖
4）、促进再生：
再分化培养基上继代培养，可促进再生
4、生根
诱导根形成培养基，也因植物不同而不同。
一般以NAA的生根效果较好，培养基中一般添加0.05－0.1mg/L，也有报道IAA生根质量较好，添加浓度一般为0.5－2.0mg/L，浓度过高，易在茎基部形成愈伤组织，影响生根质量。
另外有些植物，生根培养基中不需要添加激素，如甘薯，部分花卉
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