微藻接种及培养word版Word格式文档下载.docx
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藻种培养
1、按微藻营养模式的不同，培养方式可分为光自养、混合营养和异养三种。
（1）光自养培养
光自养是微藻的自然营养方式。
微藻的光合自养生长受到很多环境因素的影响，包括营养条件、光照、温度、pH和通气条件等。
优化上述因素以满足微藻生长的需要，是光合自养条件下实现微藻高密度培养的前提条件。
目前实现微藻高密度光合自养培养主要采用三种方法：
优化微藻培养基和培养条件，采用不同稀释比及分批补料培养避免底物抑制，或采用连续培养提高微藻生产率，以及开发具有高光能传递效率的光生物反应器。
优化培养基和培养条件可以提高微藻的生物量和代谢产物的积累。
在发状念珠藻细胞光合自养培养过程中，以BG11为基础培养基，采用中心组合设计对培养基成分进行优化，在优化后的培养基中培养20d，发状念珠藻细胞干重和多糖产量分别较优化前增加了50.6%和34.9%。
康瑞娟等在15L气升式光生物反应器中进行了鱼腥藻7120的光合自养培养条件优化，在细胞生长的适宜条件下，变光强培养5d，藻细胞干重达到1.5g/L，与文献报道相似条件相比体积产率提高2.4倍。
分批补料培养是在微藻分批培养中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。
通过向培养系统中补加物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既能保证微藻生长的需要，又不产生底物抑制，从而达到提高产率的目的。
连续培养则通过以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使反应器内的液量维持恒定，微藻在稳定状态下生长。
Fabregas等对雨生红球藻进行连续培养的研究，在优化的培养基中收获的细胞干重是分批培养的3倍。
（2）混合培养和异养培养
多数微藻是光合自养生物，但有一些微藻具有利用有机碳源的能力。
随着微藻利用有机物生长的现象不断被发现，人们逐渐认识到微藻具有一定的化能异养的能力。
事实上，许多微藻生存的自然环境如土壤、水体，尤其是废水中包含了大量的有机物质，单从生理的角度分析，大多数微藻都应具有进行化能异养生长的能力。
Vincent和Goldman认为证明微藻在自然环境中进行化能异养生长有4个依据：
所利用有机物的浓度和供给速度的分析、摄入有机物的运输系统的证据、在生理上利用有机物的能力的证据，以及有机物、光能和CO2对微藻生长的相对贡献的评估。
被微藻利用的有机物的范围较广，目前文献报道的主要包括糖类、有机酸、氨基酸和某些醇类等。
微藻利用有机物的能力因种而异，因此必须通过实验来确定。
微藻利用有机物生长表现为两种形式：
一种是可以在完全黑暗的条件下利用有机物进行化能异养生长，不再依赖光能，其表现与一般的化能异养生物并无差异；
另一种则必须在一定的光照条件下才能利用有机物，即光能自养的同时进行一定程度的化能自养，称为混合混养。
一般而言，能够进行异养生长的微藻都能进行混合营养生长，且混合营养生长速度比异养生长速度快。
例如，蓝细菌只有30种左右可以进行异养生长，但是约有半数的蓝细菌可以进行混合营养生长。
与光合自养培养相比，混合营养培养和异养培养具有生长速度快、对光的依赖减弱或不需要光照等优点，有利于进行微藻的高密度培养，是获得大量微藻细胞及其代谢产物的有效途径，而封闭式光生物反应器的研制开发为微藻的异养和混合营养培养提供了必要条件。
到目前为止，对混合培养生长过程的研究主要集中在螺旋藻、小球藻、集胞藻、鱼腥藻和发状念珠藻等。
这些微藻混合营养生长的特征为：
当藻细胞密度较大时表现为线性生长；
密度较小时，先对数生长，后线性生长。
在相同光照强度下，混合营养生长速度为异养生长速度和光合自养生长速度之和。
因此一般认为微藻在进行混合营养生长时，藻细胞内光合自养和异养代谢是两个独立的过程。
但是也有研究认为微藻细胞内两个代谢过程相互影响。
微藻的异养培养方式排除了培养过程对光的需求，通过同化葡萄糖等有机物提供细胞生长所需的能量和结构物质，所有操作和整个培养过程是在无菌条件下进行，可以利用传统的微生物发酵罐进行微藻的异养生长。
由于有机物为碳源和能源，不受光照的限制，因此可以达到较高的培养浓度。
但是异养培养也存在一些问题：
可异养的藻种有限；
培养基营养丰富，易被细菌污染；
高浓度底物的抑制作用，难于合成光诱导产物。
目前已经报道可以异养的微藻只有小球藻、隐甲藻等少数几种，其中小球藻异养培养已经实现了产业化，日本和我国台湾用葡萄糖和乙酸作碳源在不锈钢罐中异养培养小球藻生产健康食品原料。
2按培养方式不同可分为批次培养、流加培养、半连续培养和连续
培养。
2.1批次培养
微藻批次培养模式具有操作简单、成本低的优点，是实验室内普遍采用的一种培养方式。
在不同培养条件下，研究微藻细胞内特定组分的积累规律和进行最佳培养条件的优化，可为人工控制、调节和提高微藻生长和合成特定产物提供一种简便易行的研究方式。
微藻细胞内某些组分的合成与微藻细胞生长阶段密切相关。
在微藻生长的不同阶段，其胞内各组分含量差异较大，如某些藻类的总脂肪含量在静止期明显高于其它时期。
据报道，纤细角毛藻在静止期末期总脂肪含量是指数生长期的9倍；
裸甲藻静止期的脂肪产量是对数生长末期的30倍，可达到30mg/（L·
d）；
微拟球藻静止期的总脂肪含量是对数生长末期的1.3倍。
对于大多数微藻来说，通过诱导可使细胞内特定组分得到大量积累，即在营养盐限制或者缺乏条件下才能大量合成特定组分，在这种情况下，采用批次培养便于严格控制诱导条件，有利于获得目标产物。
氮是微藻生长最重要的营养元素之一，大量研究已经证明，氮缺乏可诱导油脂、虾青素和β-胡萝卜素含量的明显增加，其中以缺氮诱导提高微藻油脂含量方面的研究最多。
在氮缺乏条件下脂肪含量明显提高，微绿球藻UTEXLB1999提高1.5倍，微拟球藻（Nannochloropsissp.F&
MM24）提高了2倍，土壤藻（Neochlorisoleoabundans）提高了将近4倍，普通小球藻（C.vulgaris）提高了22%，另一种小球藻（C.emersonii）提高了34%。
此外，缺氮条件也有利于盐藻胞内
β-胡萝卜素的积累。
有报道称，在缺氮条件下，盐藻胞内β-胡萝卜素含量可高达57.4pg，是高氮培养条件下的2倍左右。
缺氮也可诱导雨生红球藻虾青素的大量积累，Borowitzka报道，雨生红球藻的绿色游动细胞在含0.01g/LKNO3培养基中培养10d即全部转变成红色细胞，当KNO3浓度为0.1g/L时，培养38d时才有部分红色细胞形成。
由此可见，批次培养有利于实现特定诱导条件，在大规模生产特定目标产物的培养中发挥着重要作用。
近年来，利用微藻处理污水也是微藻培养的研究热点之一。
用微藻处理污水，主要目的是去除污水中的氮、磷或者重金属等污染物，通过微藻培养，使污水中的污染物降到很低的水平，以期达到排放标准。
在这种情况下，采用批次培养模式可充分利用微藻生长有效去除污染物，尤其是去除双价金属离子的能力是其它培养模式所不能比拟的。
综上所述，批次培养模式操作简单、成本较低，在研究不同条件下微藻的生长及特定物质积累中得到了广泛的应用。
在进行批次培养时，微藻消耗营养盐尤其是氮、磷的速度较快，容易造成培养液中氮、磷营养盐的缺乏，藻细胞的生长和增殖受到限制，在这种条件下，藻细胞内可积累一些特定的物质（如油脂、类胡萝卜素等）。
近年来，批次培养在
“两步法”藻细胞特定产物的规模培养中得到了较广泛的应用，第一步提供足够的营养盐进行批次培养，使藻细胞积累较高的生物量，第二步实现营养元素的缺乏或限制，从而提高微藻体内特定目标产物的含量。
由此可见，批次培养有利于实现诱导条件，在诱导产油、产虾青素和产胡萝卜素的大规模培养中发挥着独特的作用。
2.2流加培养
流加培养也称为分批补料培养,是指在培养中间歇或连续向反应器中加入一种或多种营养物质，但不同时取出培养液的培养方法，其基本特点是通过改变进料速率控制反应器中的营养物浓度，在藻类培养中有较多的应用。
在微藻培养中，碳、氮、磷是微藻培养必不可少的营养物质，但对于部分藻种而言，过高的CO2、氨或磷浓度会对微藻的生长产生抑制或毒害作用。
采用分批补料培养模式，能有效解除营养盐抑制效应，同时还能维持微藻生长所适宜的培养环境。
与分批培养相比，分批补料培养能够较好地控制培养液中营养盐的浓度、显著提高微藻生物量和最终目标产物的产量，并且能够有效提高营养盐的利用率。
在产烃葡萄藻的培养中，通过流加KNO3和K2HP04，能将产烃葡萄藻的生物量从分批培养的1.3g/L提高至1.9g/L，并且烃含量提高了7%;
在小球藻和栅藻的培养中流加氮源，可以延长藻细胞的线性生长期，最终生物量比分批培养分别提高了0.68g/L和0.99g/L。
分批补料培养的发展至今，种类众多。
按补料方式分，有连续流加、半连续流加和多周期流加
;
按流加速率分，有恒速流加、指数流加和变速流加;
按反应器的体积分，有恒体积流加和变体积流加;
按反应器的数目分，有单级和多级;
按有无反馈分，又有反馈控制流加和无反馈控制流加。
Braue从物料流入速率和流出速率对分批补料培养进行了分类（图1-8）。
微藻分批补料培养中常用恒速流加和变速流加方式，分别是以均匀的速度和非线性的速度进行一种或多种营养盐的补加。
然而，一般采用的恒速流加或变速流加都是按照预先设定的规律加以控制，虽然操作比较简单，但是不能真实反映微藻培养中营养盐浓度的变化，属于前馈控制流加，需要控制模型绝对的精确才能较好的控制营养盐的水平。
此外，若培养中出现意外状况时（如藻状态不佳生长缓慢、培养条件突然改变、微藻生长受到污染等），这种补料方式没有应变性。
如果要根据藻细胞的生长状态适时调整微藻培养液中营养盐浓度，必须进行反馈控制流加，即通过检测培养中某些重要参数的变化，来确定相应营养盐的流加速率。
反馈控制流加能够控制培养液中营养盐水平基本稳定，从而维持适合细胞或某种代谢产物生成的环境稳定，比盲目的恒速流加及变速流加更有利于生物量或产物的积累。
反馈控制流加又可以分为直接反馈流加和间接反馈流加。
直接反馈流加是通过在线测定培养液中某种限制性营养盐浓度的大小，及时调整流加速率，将营养盐浓度控制在预期范围内。
但目前只有少数几种营养盐（如氨、硝酸根等）能够实现在线测量，而且容易受到培养液中其它离子或有机物质的影响，误差较大，因此其应用范围受到了限制。
间接反馈流加是通过对一些能够反映细胞代谢及营养盐变化规律的外部参数，如CO2消耗速率（CUR）、溶氧（DO）、pH、生物量等进行检测，作为控制流加速率的依据。
目前，间接反馈流加多用于微生物培养。
在微藻培养中，采用反馈控制营养盐流加的方法还鲜有报道。
随着对分批补料培养研究的深入，在补料方式、优化控制等方面都取得了很大进展，虽然仍然是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，但在某些情况下，如多级重复补料，分批补料培养的概念淡化，己非常接近于连续培养。
采用分批补料培养能解决分批培养中营养盐限制或抑制的问题，延长微藻的线性生长期，提高产量。
在微藻培养特别是高密度微藻培养中有着非常重要的意义。
2.3半连续培养
半连续培养是在一次性培养的基础上，当藻细胞达到一定浓度后，收获一定量的藻液，补充等量培养液继续培养。
半连续培养不仅广泛用于大规模培养，也是微藻实验室研究中常用的培养模式。
在半连续培养过程中，由于定时采用新鲜培养液替代等量的原培养液，使培养液中营养成分增加，生物密度下降，透光率增加，因此，藻体光合效率增强，生长速率增快，有利于藻细胞保持良好的生长状态。
更新率作为半连续培养模式中最重要的参数之一，对微藻的生长和细胞内生化组分都有重要的影响。
当外界条件一定时，特定藻株的最适更新率是一定的。
当更新率过高时，造成培养液中藻细胞浓度很低，即使补充充足的营养盐，单个细胞的生长速率达到最大，单位体积培养液的生物量仍然很低；
反之，当更新率较低时，造成藻细胞生长所需的营养盐不足，光强较弱，严重影响生物量的积累，从而影响藻细胞的产率。
在很多情况下，半连续培养微藻的更新率为20%～30%，如雨生红球藻、淡水微藻（Parietochlorisincise）在20%更新率下的细胞产率达最大值，明显高于其它更新率的细胞产率；
杜氏藻（Dunaliellatertiolecta）在20%～30%更新率下的日采收量可高达3
×
106个/（mL·
d），分别是40%，50%更新率时的1.5倍和2倍；
绿色巴夫藻、隐藻（Chroomonassp.）的细胞产率也在更新率为30%时达到最高值。
由于微藻更新率不仅影响微藻的细胞密度，而且影响微藻的生长速率，因此可在合适的更新率条件下结合营养盐的限制添加，在不降低生物量的同时促进细胞内油脂的积累，为微藻生物质的大规模生产以及微藻生物能源的发展提供重要的培养技术。
在更新率为25%并限制添加氮源的条件下，小球藻（chlorellasp.）的油脂产率达最大值，为0.139g/（L·
d），明显高于批次培养模式和流加培养模式；
当更新率为40%时，在室外大规模培养微拟球藻（Nannochloropsissp.F&
M-M24），在限氮条件下每天的油脂产率可达204mg/（L·
d），比营养盐充足的对照组高87mg/（L·
d）。
据此推算，该藻的产油量可达20t/（a·
hm2），从而证明了微藻生物质规模培养的可行性；
当更新率为50%时，微拟球藻（N.oculataNCTU-3）生物量和油脂产率分别可以达到0.497g/（L·
d）和0.151g/（L·
d），比更新率为60%时分别高0.201g/（L·
d），0.030g/（L·
近年来，半连续培养在微藻油脂积累方面的应用研究越来越多，实践证明，半连续培养模式是微藻规模生产生物柴油的最佳培养方式之一。
在半连续培养模式下，不同微藻的最适更新率有所不同，不同培养系统中微藻的最适更新率差异也较大。
因此，在进行半连续培养时，须要根据不同的藻种及培养系统选择合适的更新率，以提高大规模培养微藻的生物质产量。
2.4连续培养
连续培养是指以一定的流速连续向培养系统内添加新鲜培养液，同时以相同的速度流出培养液，使反应器内的细胞生长环境处于恒定状态。
这种恒定状态使细胞生长处于一个稳定的环境中，细胞的生长速度、代谢活性处于相对恒定的状态，从而达到稳定高速培养微藻或产生大量代谢产物的目的。
稀释率是连续培养模式中最重要的参数，它直接影响微藻的生物质产量、细胞产率以及代谢产物的积累。
大多数微藻在一定稀释率范围内连续培养时，生物量随着稀释率的增加而增加，当稀释率超过临界值后，藻细胞未能充分生长便被冲走，生物量反而会随着稀释率的增加而下降。
大量研究表明，微藻连续培养时都存在一个最佳稀释率，如杜氏盐藻、三角褐指藻的最佳稀释率为0.15d-1、栅藻为0.31d-1，藻细胞在最佳稀释率下生长，达到稳态时的生物量明显高于其它稀释率下的生物量。
有些微藻在合适的稀释率下进行连续培养时，其生物量产率明显高于批次培养的生物量产率。
雨生红球藻在氮充足、稀释率为0.9d-1条件下的生物量产率可高达1.2g/（L·
d），远远高于批次培养时的产率0.1g/（L
·
鲁兹帕夫藻（Pavlovalutheri）在稀释率为0.297d-1时的生物量产率比批次培养高0.084g/（L·
当细胞浓度较低时，螺旋藻批次培养的生物量产率大于连续培养，当细胞浓度较高时，连续培养的生物量产率大于批次培养，且在稀释率为0.45d-1时，生物量产率达到最大值。
以特定稀释率进行连续培养时，微藻细胞处在一个稳定的环境中生长，细胞代谢活动相对稳定，从而能够高效稳定地产生某些重要的代谢产物。
研究表明，与批次培养相比，连续培养模式更有利于某些微藻细胞内代谢产物的积累，如单针藻（MonoraphidiumspGK12）在稀释率为0.64d-1时，细胞内虾青素的含量能够达到0.3～0.4pg，明显高于批式培养的含量；
富含PUFA的鲁兹帕夫藻（Pavlovalutheri）在稀释率为0.297d-1时，EPA和DHA的产率均高于批次培养的产率；
当稀释率为0.9d-1，硝酸盐浓度为1.7mM时，雨生红球藻诱导产虾青素的厚壁孢子，得到最大的脂肪酸含量为7.6%，这比非连续培养下的油脂含量高4.3%。
以最佳稀释率进行连续培养时，细胞的生长环境相对稳定，细胞处于优化的生长条件下，从而使细胞生理代谢达到一种稳定状态，微藻生长稳定且生长速率快，藻细胞稳定的生长状态对于微藻合成某些重要次生代谢产物具有重要作用。
因此，连续培养不论是在稳定高产微藻生物质方面，还是在稳定生产某些重要代谢产物方面，都发挥着其它模式所不能替代的作用。
3、培养条件
环境因素是影响藻类生长和代谢的主要因素之一。
在不同的环境条件影响下，一种藻的生长状态和内部能量变化都产生微妙的变化。
在掌握了环境因素对藻类培养的影响后，即可以做到在实验时排除不必要的影响因子，使得实验的关键因素可以更加准确，稳定。
实验中各变量是在其他相关量确定的基础上进行调整。
以此来寻找到一个最佳的试验条件。
同时，为了提高数据可靠性与准确性，实验中的各项数据均为与平行样的平均值。
3.1培养温度
单细胞藻类在光合作用的过程中，需要一定的温度范围。
温度的变化例如升温或者降温的时候会对光合作用有一定的促进或者抑制作用。
有研究指出光合作用和呼吸作用的强度都会被温度所影响，而这两大支柱却都是和微藻的生长代谢有着紧密的关系。
并且微藻属于生态热型微生物，它们必须从环境中得到热源，温度的大幅度变化会导致生长速率，新陈代谢效率和细胞内的生化反应速度。
因此培养时的温度是影响单细胞微藻生长的重要因素之一。
微藻可以适应的温度往往在15～40℃之间。
而且不同种类的微藻所适应的范围也有所不同。
单细胞的绿藻小球藻最适合的温度上限在36℃左右，而最合适的温度应在25～32℃之间。
在一组实验中，为了确定的无光培养状态下，在其他因素稳定的条件里，找到最节能而且效率最高的的培养温度。
该实验中的温度变化分为20、25、30、32℃几个标准。
光照为0lux;
初始pH为6．8;
摇速为160rpm;
通气量为50mL/d;
培养基为BG培养基;
葡萄糖碳源浓度为1g/L，培养72h。
通过上表3所示，可以看出当培养温度在27．5和30℃时，吸光度（540nm）相同且最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长温度为27．5℃。
3.2初始PH
培养基中的初始pH值会影响微藻生长及新陈代谢等很多生化反应的一个重要因素，pH会干涉光合作用里二氧化碳的使用性，同时在呼吸作用中将会影响微藻利用有机碳源效率。
并且因为pH可以影响细胞壁的渗透性能，从而会使得细胞对培养液中的营养离子的吸收和利用受到一定的影响。
同时新陈代谢的中间产物的重复利用和藻内毒性也会有一定影响。
与温度和光照相同，最适合藻类生长的pH在不同藻种间各有不同。
有研究指出，最适合微藻生长的pH在5到8之间，pH7是最合适的。
还有研究指出，因为生长过程中微藻会因为二氧化碳的吸收使pH升高，所以最佳的初始pH应该为6左右。
某研究在pH5到10这个范围中考察富有油小球藻C．protothecoides3的生长情况和油脂累积效果。
实验为了找到一个最适合有油小球藻C．protothecoides3生长和油脂累积的pH值。
设置pH变化分为5．5、6．5、7．5、8．5几个标准。
温度为25℃;
葡萄糖碳源浓度为1g/L，接种量1∶5，培养72h。
实验结果见表4。
通过上表4所示，可以看出当初始pH值在5．5时，吸光度（540nm）最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的初始pH值为5．5。
3.3接种量
初始接种影响藻种的繁殖速度，在BG培养基、初始pH自然状态、光照强度0lux、培养温度25℃的条件下培养时间72h。
通过上表所示，可以看出当接种量在1∶5时，吸光度（540nm）最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的接种量为1∶5。
3.4有机碳源
有机碳源的浓度对藻种生长速率有重要的影响，在BG培养基、pH值自然状态、光照强度0lux、接种量1∶5、培养温度25℃的条件下培养时间72h。
通过表6所示，可以看出当培养基为BG+2g/LC6H12O6时，吸光度（540nm）最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的培养基为BG+2g/LC6H12O6。
综上，实验研究表明微藻最适生长条件为接种量1∶5、初始pH值5．5、培养温度27．5℃和BG+2g/LC6H12O6培养基。
（注：
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