生物技术考试要点.docx
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生物技术考试要点
生物技术：
也称生物工程指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，利用生物得体或其体系或它们的衍生物来制造人类所需要的各种产品或达到某种目的的一门新兴的综合性的学科。
基因工程：
指在基因水平上的操作并改变生物遗传特性的技术。
即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA分子）在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表达的操作，也称DNA重组技术。
细胞工程：
是指在细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。
酶工程：
是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。
发酵工程:
是结合微生物学生物化学化学工程学的基本原理利用微生物生长和代谢活动来生产各种产品的工程技
转化：
将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。
工具酶：
应用于基因工程的各种酶的总称，分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶。
基因工程载体：
承载外源DNA片段带入受体细胞的传递者。
目的基因：
在基因工程设计和操作中被用于基因重组改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因成为目的基因。
感受态细胞处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。
转导：
通过噬菌体的DNA构建的克隆载体在体外包装成颗粒后，感染受体细胞使其携带的重组DNA进入受体细胞的过程。
基因重组：
利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，使目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到正确表达。
基因探针：
只带有检测标记且顺序已知的与目的基因互补的核酸序列。
细胞全能性在多细胞生物中每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因只要条件许可可发育成完整的个体。
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞在一定条件下可分化成多种功能细胞分为胚胎干细胞和组织干细
愈伤组织：
是植物细胞脱分化后形成的一种无定形状态的薄壁细胞
外植体指植物组织培养中用于进行无菌培养的离体材料。
限制性内切酶：
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
细胞融合：
是指两个或多个细胞相互接触，细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程
原生质体再生原生质重新长出细胞壁进而形成正常植株
单克隆抗体：
从某个特定的B淋巴细胞培养繁殖出的大量细胞群体，由此分泌的抗体
体细胞克隆：
指动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态，采用核移植方法，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞核为核供体，供体核在去核卵母细胞中启动卵裂进而克隆出动物
液体发酵：
在液体培养基中进行微生物发酵的方式。
下游加工：
从发酵液中分离、精致有关产品的过程
连续发酵：
以一定速度向发酵罐内添加新鲜培养基，并以相同速度流出培养液，是发酵罐内液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长
固定化酶：
在一定空间内呈闭锁状态存在的酶
植物组织培养：
是指从植物体内取出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，根据植物细胞具有全能性，通过无菌操作，在人工控制下进行培养以获得完整植株。
生物传感器：
是由固定化的生物敏感材料作识别元件与适当的理化换能器及信号放大装置构成的分析工具或系统。
载体：
分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。
培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。
基因文库：
将大分子量的染色体组DNA分子经酶切形成大小合适的DNA片段群，或是经过反转录合成不同大小适合于基因克隆的cDNA分子群体，连接到载体分子上，转入受体细胞后得到的克隆的集合体，叫基因文库。
断裂基因：
在基因编码序列中有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列，使一个基因分隔成不连续的若干区段
多克隆位点：
DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
cDNA文库：
通过一系列的酶催作用，使总poly（A）mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。
如此便构成了包含产所有基因编码的cDNA文库
脱分化：
离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化
细胞分化;由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程称为细胞分化
同裂酶:
指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶
同尾酶:
是与同裂酶对应的一类限制酶，虽然来源各异识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。
转染:
是专指感受态的真核细胞捕获和表达病毒载体DNA分子的生命过程。
多能性:
指胚胎干细胞可以分化成各种不同的细胞类型并参与到发育过程中，一个基本的标准是胚胎干细胞具有向三个胚层分化的能力
全能性:
是指单个细胞在一定条件下分化发育成为完整个体的能力。
细胞系指由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群。
细胞株：
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株，即细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
转基因动物：
是指在基因组中稳定地整合有导入的外源基因的动物。
转基因植物：
是指通过体外重组DNA技术将外源基因转入到植物细胞或组织，从而获得新遗传特性的再生植物。
细胞培养：
是指微生物细胞或动物细胞、植物细胞在体外无菌条件下的保存和生长，即细胞或组织在体外人工条件下的无菌培养、生长增殖。
抗原：
凡能刺激机体免疫系统发生免疫应答的物质均称为抗原。
连接酶：
能够催化双链DNA片段3’、5’末端形成磷酸二酯键的酶。
细菌质粒载体：
是存在于细菌细胞质中的一类独立位于染色体外的能够进行自主复制的遗传成分。
噬菌体载体：
把专门感染了细菌的病毒称为噬菌体载体，由DNA（头部）和蛋白质（尾部）组成。
溶源：
若噬菌体侵入宿主细胞后并不裂解宿主细胞，而是把自身的DNA整合到宿主细胞DNA中，并随着宿主细胞分裂而增殖。
裂解：
若噬菌体侵入宿主细胞后，可以利用宿主细胞的酶以及底物合成新的噬菌体，然后破裂细胞释放出子代噬菌体并再次感染其他宿主。
受体细胞：
（宿主细胞）是指能够摄取外源DNA，并使其稳定扩增以及表达的细胞。
细胞培养技术：
是指将植物、动物和微生物的细胞在无菌条件下的保存和生长。
细胞融合技术：
采用自然或人工的方法使两个或两个以上的不同细胞或原生质体融合为一个细胞，不经过有性过程而得到杂种细胞。
细胞重组技术：
是指从活细胞中分离出细胞器或其他组分，将不同来源地细胞器在体外进行重组，装订成具有生物活性的细胞或细胞器的生物技术。
原生质体：
除去了全部细胞壁的细胞。
胚状体：
指植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育而形成的胚状结构。
（具有根芽两节）
继代培养指愈伤组织在培养基上培养一段时间后，由于营养缺乏、水分散失和代谢产物的积累等原因需将这些组织转移到新的培养基上这种转移称为继代培养或传代培养。
植物细胞培养：
在离体条件下，将植物的愈伤组织或易分散的细胞培养到培养基上，经过培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的技术。
组织培养：
是指在无菌和人工控制环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞和完整植株的技术。
人工种子：
外面包裹有一层有机薄膜的胚状体。
自然选育：
不经过人工处理，直接利用微生物的自然突变进行选育。
（短波辐射、低剂量使用、四种碱基磷间互变异构、宇宙射线？
）
基因工程常用的工具酶和载体有哪些1）常用的工具酶有：
限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶、反转录酶2）基因工程常用的载体有质粒载体、噬菌体和动植物病毒载体。
基因工程中将目的基因导入受体所用的载体要求的条件是什么1）具有允许外源DNA片段组入的克隆位点（限制性内切核酸酶的识别序列）2）能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制3）必须具有选择性标记，以便筛选克隆子4）必须安全，不含对细胞有害的基因，不会任意转入其他生物
基因工程中，把目的基因分离出来的方法主要有哪些1）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因（鸟枪法）2）利用PCR直接扩增目的基因3）目的基因的化学合成4）通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因。
何谓PCR简述原理和步骤聚合酶链式反应polymerasechainreaction,，也称为DNA扩增反应体系构成：
1）DNA模板2）引物3）dNTP以及模版4）TaqDNA聚合酶、Mg+，buffer原理：
实质为体内DNA复制的体外模拟。
当双链DNA变性为单链后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物的四种dNTPs，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的DNA互补链步骤：
高温95变性，低温55退火及适温75延伸三个步骤循环周期的多次重复
基因工程中，将目的基因导入受体后，对摄入重组DNA分子的转化细胞进行筛选和检测以及鉴定的方法有哪些1）根据载体选择标记基因筛选转化子2根据报告基因筛选转化子3）根据形成的噬菌斑筛选转化子鉴定：
免疫学方法、原位杂交southern印迹以及酶切电泳，PCR,DNA芯片测序
简述在基因工程中目的基因与载体结合的重组工艺过程用同一种限制性内切核酸酶切割含有目的基因的外源DNA和载体DNA，产生具相同粘性末端的DNA片段，在DNA连接酶的作用下，载体切口的粘性末端与目的基因DNA片段两端的粘性末端即可因碱基配对互补结合而形成重组DNA分子（平齐末端、同聚物加尾，人工接头连接
简述外源基因导入受体细胞的途径：
转化：
把以质粒为载体，构建的重组分子导入受体细胞的过程。
转化态细胞指处于能够摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。
转导：
以噬菌体或真核病毒为载体构建的重组分子导入受体细胞的方法。
转导时重组分子先进行体外包装，然后导入受体细胞。
感染：
当重组DNA分子不能直接转导或转化时，将含有DNA分子的供体菌，含有被转化的受体菌，含有辅助质粒的辅助菌，三者共同培养。
在辅助菌的作用下，将供体菌导入到受体菌中。
植物组织培养的大概步骤植物组织培养要进行5个阶段：
预备阶段：
1选择合适的外植体，一般以幼嫩的组织器官为宜2除去病原菌及杂菌，外植体—自来水多次漂洗—消毒剂处理—无菌水反复冲洗—无菌滤纸吸干3配置适宜的培养基。
由于物种的不同培养基也多种多样诱导去分化阶段：
就是让外植体去分化，使各细胞处于旺盛有丝分裂的分生状态继代增值阶段：
愈伤组织长出后经过几周的迅速分裂，原有的培养基中的水分及营养物质多以耗失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累，因此必须进行移植切割成数块后继代增值生根发芽阶段：
通常愈伤组织要移植于含有适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的产生移栽成活阶段：
生长于人工照明玻璃瓶中小苗，要移栽到室外以利成长。
此时的幼苗还十分幼嫩，移栽应在能保证适度的光温、湿条件下进行。
原生质体分离-纯化-培养-细胞壁再生-细胞分裂形成细胞团-愈伤组织-产生器官-分化完整植株
简述单克隆抗体产生的技术原理将能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
由于杂交瘤细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们既能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，又能表现出骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量繁殖的能力，从而可通过大规模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。
何谓细胞融合？
诱导细胞融合的方法有哪些又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
诱导细胞融合的方法：
生物法—仙台病毒法化学法—PEG结合高Ca＋、高pH诱导法物理法—电融合诱导法
简述植物组织培养时培养基的组成及其作用含有丰富的基本成分如蔗糖葡萄糖以及氮磷钾镁等和微量无机物铁锰硼酸等，满足细胞生长分裂的营养需要，且含有微量有机物吲哚乙酸，激动素肌醇等较高的生长素对细胞分裂素比值有利于引导产生愈伤组织，反之促进胚芽和培根分化
简述微生物细胞原生质体融合的优点目的性较强、生长迅速，便于多次筛选，避开了种间的生殖隔离，且操作简单
比较植物细胞和动物细胞原生质体制备过程异同点同：
得到的都是细胞膜包裹的原生质体异：
植物细胞需机械法或酶解分离法除去细胞壁，动物不需要
简述发酵工程的基本过程1）发酵原料的预处理：
对发酵原料进行粉碎、蒸煮、水解等2）发酵过程的准备：
进行种子制备和无菌消毒3）发酵过程：
由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应过程，分为厌氧性发酵和好氧性发酵两种类型4）产品的分离与纯化：
从发酵液中制取符合质量指标的产品。
比较常用的发酵方法及其优缺点分批发酵优：
操作简便；缺：
生产力不高连续发酵优：
维持稳定条件，有利于微生物生长代谢，保持稳定的产率和产品质量；可实现机械化自动化；减少设备清洗，准备和灭菌等非生产所用时间，提高利用率，省工省时；灭菌次数少，提高测量探头寿命；易对过程进行优化，提高发酵产量；缺：
是开放系统，发酵周期长，易造成杂菌污染；长周期连续发酵中微生物易发生变异；对设备要求高；易生菌补料分批发酵优：
解除营养物质抑制产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应；缺：
抑制所需产物合成的同时，也抑制其他一些碳源氮源的分解利用
空气霉菌方法有哪些物理：
紫外灯照射，静电吸附和空气过滤化学：
消毒剂蒸熏，含氯消毒剂，过氧乙酸进行低容量喷雾消毒
发酵过程种子制备过程1无菌方式进行爆仓的菌种接种在斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落到事关斜面和摇瓶2菌种产孢子能力强，孢子发芽，生殖迅速，可用固体培养基培养孢子3能力不强，发芽慢，可用药瓶液体培养法4不产生孢子的菌种，保藏基础上在一定温度下活化即可，在经摇瓶后即可成为种子罐种子
在生产酶的过程中采用什么样的方法提高酶产量1添加诱导物2添加促进剂3控制阻遏物的浓度：
代谢终产物、分解代谢产物
固定化酶和游离化酶相比，固定化酶的优势组要表现在哪些方面？
固定化酶：
通过物理或化学的方法将酶束缚在一定空间里，将酶制成仍具有催化活性的衍生物。
其优点是：
1）可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中收回2）酶的稳定性有所改进3）酶的作用效率提高。
如何制备固定化酶1载体结合法：
共价结合法（反应条件苛刻，操作复杂，结合牢固，活性不高酶易失活）、离子吸附法（反应条件温和，操作简便，结合不牢固，活性高）、物理吸附法（反应条件温和，可重复使用，结合力弱，酶易解析）2共价交联法：
双功能试剂（反应激烈，固定化酶的回收率低）3包埋法（回收率高，活力高，但只适用于小分子底物和产物酶）：
聚合物包埋法、微胶囊包埋法
基因工程中主要的工具酶有哪些，他们的作用是什么限制性内切酶：
是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
连接酶：
连接作用是通过DNA连接酶在体内或体外作用而完成的。
这种酶催化DNA上裂口两侧（相邻）核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来修饰酶：
1DNA聚合酶：
通过缺口转移法制备分子杂交中的探针2Klenow酶：
主要用途:
1将粘性末端制备为平末端2.对具有3’隐蔽末端的DNA片段作末端放射性标记,3.cDNA克隆中第二链cDNA的合成,4.DNA序列的测定.3T4DNA聚合酶,：
主要用途:
1.将任何形式的双链DNA端制备成平末端的双链DNA,2.对双链DNA3’末端的作末端标记.4T7DNA聚合酶和修饰的T7DNA聚合酶,：
多用于DNA测序中5aqDNA聚合酶：
在较宽的温度范围内都保持着催化能力，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需要。
基因工程常用的载体有哪些性质1）能在宿主细胞中进行独立的稳定的DNA自我复制2）已于从寄主细胞中分离并进行纯化3）在其DNA序列中具有适当的限制性内切酶位点4）具有能够观察的表形特征。
基因工程中，目的基因在受体细胞内的正确表达主要受哪些因素影响1）目的基因必须必处于正确的阅读框架中2）目的基因的阅读框架与载体DNA的起始密码子相吻合3）载体的目的基因上游必须连有一个适当的启动子4）目的基因的蛋白质产物能在受体细胞内形成融合蛋白。
简述一下内切酶和连接酶的作用机理内切酶：
类型Ⅰ、Ⅲ：
都有甲基化，依赖于ATP，限制性内切酶活性。
Ⅲ型酶在识别部位进行切割很容易从底物上解离。
Ⅰ型酶是随机切割，识别部位不等于切割部位，能长生不同的末端。
类型Ⅱ的特点：
识别部位不等于切割部位1）在DNA双链特异性识别部位进行切割产生特定的DNA序列2）两个单链部位在DNA分子上不是彼此相对的3）断裂的结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。
连接酶：
能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH末端与5-P末端形成磷酸二脂键，使俩末端相连。
连接方法1）用DNA连接酶连接具有互补的粘性末端片段2用T4DNA连接酶将末平端片段连接3）平末端片段片段加上衔接头或人工合成的连杆使之成为粘性末端后用DNA连接酶连接。
简述质粒、噬菌体、柯斯质粒载体的特性质粒：
1）具有复制起点2）带有可供选择的标记3）含若干限制性内切酶的位点4）分子量小5）拷贝数高噬菌体：
1）具有双链的复制型DNA，可如质粒一样进行遗传操作2）对大肠杆菌有很强的感染力3）λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖柯斯质粒载体：
1）具有质粒的复制起点和药物抗性基因2）具有λ噬菌体载体的COS位点3）分子量小，但有高容量的克隆能力4）具有与质粒同源徐磊的质粒进行重组的能力。
试述基因工程中，将目的基因导入受体后，对摄入重组DNA分子的转化细胞进行筛选和鉴定的方法转化细胞的筛选：
1）利用克隆载体携带的选择标记基因筛选克隆子：
利用抗生素抗性基因和相应的选择药物进行筛选；利用载体除草剂抗性基因和相应的选择药物进行筛选；利用乳糖操纵子lacZ’基因互补显色进行筛选；根据生长调节剂非依赖型基因进行筛选；根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补进行筛选2）利用克隆载体携带的报告基因进行筛选：
β-葡醛糖酸酶基因（gus）、萤火虫荧光素酶基因（luc）和绿色荧光蛋白基因（gfp）3）根据形成噬菌斑进行筛选。
重组子的鉴定：
1）根据重组DNA分子特征鉴定：
根据重组DNA分子大小进行鉴定，根据重组DNA分子限制性内切酶酶切图谱进行鉴定，根据PCR扩增片段进行鉴定，采用DNA杂交法进行鉴定，应用DNA芯片进行鉴定和根据DNA核苷酸序列进行鉴定2）根据目的基因转录产物（mRNA）进行鉴定3）根据目的基因翻译产物进行鉴定：
利用蛋白质凝胶电泳法和免疫检测法进行鉴定。
试述基因工程中将目的基因转移到受体中的方法，并说明各自的原理1）选择合适的克隆载体，将目的基因与载体连接成为重组DNA分子2）选择合适的受体细胞：
原核生物细胞、植物细胞和动物细胞3）基因转移的方法：
原核生物细胞可通过转化、转导和三亲本杂交等途径将重组DNA分子导入受体细胞。
重组DNA分子导入植物细胞可用根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法（叶盘转化法）、重组DNA的直接转移法（电穿孔法、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法和花粉管通道法等）。
重组DNA分子导入哺乳动物细胞可采用病毒颗粒转导法、磷酸钙转染法、脂质体介导转化法、显微注射法、精子介导法等）。
基因工程研究的理论依据是什么①不同基因具有相同的物质基础②基因是可以切割的③基因是可以转移的④多肽与基因之间存在对应关系⑤遗传密码是通用的⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。
生物技术中，作为理想的受体细胞，应该具有何种特点①便于重组DNA分子的导入和筛选克隆子②重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持③适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累，对于真核目的基因的高效表达，应具有较好的翻译后加工机制④遗传性稳定，对遗传密码的应用上无明显的偏倚性⑤易于扩大培养或发酵生长，具有较高的生产应用价值和理论研究价值⑥安全性高，不会对外界环境造成生物污染。
将目的基因导入受体细胞的方法有哪些①化合物诱导转化法②电穿孔转化法；微弹轰击转化法；激光微速穿孔转化法③超声波处理转化法④脂质体介导转化法⑤体内注射转化法；花粉管通道转化法；精子介导法；低能离子束介导转化法。
植物细胞培养的方法有什么单细胞培养单倍体培养、原生质体培养、固体培养、液体培养、固体化培养、悬浮培养
动物细胞融合包括哪些方法病毒诱导融合；化学诱导融合；电激诱导融合
论述动物克隆技术的正确操作的过程1核供体动物的选择与细胞核的获得2核受体动物的选择与细胞核的移出3供体核的移入及原核的取出4）胚泡的体外试管培养5）代母的选择与胚泡移入子宫6）克隆动物的体内发育与出生。
论述单克隆抗体生产的基本过程亲本细胞的选择→细胞融合→抗体的检测与杂交瘤选择→单克隆抗体的大量生产→单克隆抗体的鉴定1）亲本细胞的选择：
一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养2）细胞融合3）抗体的检测与杂交瘤选择：
杂合细胞的选出是本技术的关键，通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞4）单克隆抗体的大量生产及鉴定：
待其增殖成一个细胞群体后，有特异技术分别检测他们产生的抗体，从中挑出能产生所需单一性抗体的杂合细胞5）杂交瘤细胞的克隆化培养；利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。
论述基因工程的基本操作过程第一步：
目的基因的制取：
可用反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法；第二步：
基因载体的选取:
用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒；第三步：
DNA的体外重组；第四步：
DNA重组体导入受体细胞；第五步：
受体细胞的繁殖扩增:
含重组DNA的活受体细胞，再在适当的培养条件下，进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加；第六步：
克隆子的筛选和鉴定；第七步：
目的基因的表达。
什么是载体？
载体的特点。
基因工程中常用的载体有哪些，他们分别有什么特点分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。
载体特点：
1至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制2至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入3至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞常用的载体：
质粒载体λ噬菌体的衍生物柯斯质粒病毒载体和人工染色体载体质粒载体：
①染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。
本身大小为1-200kb，可容纳外源插入片段大小10kb左右，不超过15kb②能自主复制，是能独立复制的复制子③质粒对宿主生存并不是必需的。
λ噬菌体的衍生物：
噬菌体是一类细菌病毒的总称。
λ噬菌体载体，线性双连DNA分子，本身48.5kb，可容纳10-20kb外源基因。
其左右两端各有一个12核苷酸组成的5`突出的粘性末端，称为cos位点。
柯斯质粒：
具λ噬菌体特点，具有质粒DNA的特性，高容量的克隆能力，具有与同源序列的质粒重组的能力。
广泛用于基因组文库建立。
理想质粒载体必备的条件1）分子量尽量小2）应最大限度的具有各种常用RE的单一酶切位点多克隆位点（MCS），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列3）具两种以上的选择标记基因4）缺失mob基因5）易导入宿主细胞并复制和表达。
简述植物细胞融合与动物细胞融合的区别1）植物细胞有细胞壁，需要先用纤维素酶去壁，形成原生质体后，才能进行细胞融合2）植物细胞融合后形成的杂种细胞，经过培养后有可能分化发育成植株，而动物细胞的杂种细
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