RNA沉默机制研究进展.docx

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RNA沉默机制研究进展

RNA沉默机制研究进展

RNA沉默机制的研究要紧集中在遗传和生化方面。

遗传方面，各研究小组选择遗传突变子的挑选策略，即挑选RNA干与功能丧失的突变基因。

目前在拟南芥中已发觉了SGS一、SGS二、SGS3和SDE一、SDE二、SDE3和SDE4等多个参与RNA干与作用的基因，（Elmayan,1998;Dalmay,2000）而在链孢霉中发觉产生基因排除所必需的基因QDE一、QDE2和QDE3（Tijsterman,2002）基因序列分析发觉，不同生物中RNA干与相关的必需基因互为同源基因。

生化方面，Hamilton等人率先在发生PTGS的西红柿中检测到了与被沉默基因同源的、大小约为25nt的小片段RNA分子，而未发生PTGS的西红柿却没有检测到这种小分子。

（Hamilton，1999）。

Zamore等在果蝇RNA干与实验中观看到，双链RNA第一被降解成21~23nt的小片段，然后相应的mRNA也在与双链RNA同源的区段内，依照一样的距离被降解成21~23nt的小片段（Zamore，2000）。

RNAi作用分子

目前关于RNA干与中起作用的RNA小分子已有了比较透彻的研究，这些小分子目前被分为以下几类：

一种是小干与RNA分子（smallinterferingRNAs，siRNAs）；另一种是分子（MicroRNAs，miRNAs）；这是两种最要紧的作用小分子；最近又有两类参与RNA干与作用的小分子被发觉，别离是微小非编码RNA（Tinynon-codingRNAs,tncRNAs）和小调控RNA分子（SmallmodulatoryRNA,smRNAs）（VictorAmbros,2003;Kuwabara,2004）。

tncRNAs是线虫基因组中编码的一类约在20-22nt的RNA分子，它们在进化上并非保守，功能上可能与发育调控有关，具体功能目前还未有报导（VictorAmbros,2003）。

smRNAs是2004年初报导的在老鼠中发觉的一种RNA小分子，只在成熟神经细胞中调控神经细胞特异基因表达。

（Kuwabara,2004）

siRNAs小分子和miRNAs小分子是RNA干与作用中两种要紧的小分子。

二者既有不同点，又有许多相似的地方。

siRNAs是由于Dicer酶类酶切长的双链RNA前体产生的，前体来源于病毒复制本、细胞RNA-依托的RNA聚合酶（cellularRNA-dependentRNApolymerases,RDRPs）作用的结果或是基因组内反向重复片段转录的结果,5’端带磷酸基团、3’端带羟基、大小约为21-25nt的RNA分子；miRNAs分子在存在形式上大体与siRNAs分子相同，大小约为19-25nt的RNA分子；但其与siRNAs的关键不同点在于它的来源，它是Dicer酶类加工RNA聚合酶II从内源非编码蛋白基因转录产生的高度结构化的RNA前体分子而成。

但二者均依托于RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplexes,RISC）中的Argonaute蛋白的活性进行（He，2004）。

二者的区别：

1）siRNAs以双链形式存在，而成熟的miRNAs是以单链形式存在的；

2）miRNAs参与正常情形下的生长发育基因调控，在大多数的多细胞生物基因组中都有编码，它们沉默蛋白合成时期的基因，而siRNAs不参与生物体的正常生长，只有在病毒或其它双链RNA诱导的情形下才产生，它们通过与互补序列的精准配对而增进mRNA的切割或招募抑制蛋白、或直接指导DNA的修饰而起作用；

3）Dicer酶对两类RNA分子的加工进程不同；多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha和DicerRNaseIII在细胞核及细胞质分两步别离发生的；而siRNAs那么是仅由Dicer酶类作用，而且是在细胞质中加工完成的。

4）miRNAs在多细胞动物界或在有关的植物品种中是保守的，而siRNAs序列是完全多样的，在作用方式上，miRNAs并非需要与它们的靶目标完全匹配，而siRNAs那么需要与它们的靶目标完美匹配。

（（Dmitry,2004；Michael,2005）

所有的证据均支持两种小分子是以双链生成的，但在功能复合体中以单链形式集累，最有说服力的证听说明miRNAs分子最初含有两条链的证据是miRNAs的生物合成在植物及多细胞动物中都可被病毒蛋白p19所阻断，而p19蛋白结合双链的RNA小分子结构但并非结合单链的RNA小分子（（Ye，2003；Lakatos，2004），那么p19蛋白抑制miRNAs功能的最简单说明确实是miRNAs分子最初是以双链形式短暂存在的。

RNAi效应复合体的组装

RISC组装的关键步骤是将siRNAs和miRNAs小分子两条链中的一条选择进入该复合体，目前RISC复合体的体外研究只在Drosohaila取得研究。

（Lee，2004）

果蝇中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶类进行加工的，Dcr-1酶产生miRNAs小分子而Dcr-2酶产生siRNAs小分子，Dcr-2酶还指导siRNAs小分子的一条链进入RISC复合体。

人类中的Dicer酶也可能有指导siRNAs小分子进入RISC复合体的功能，因为Dicer酶缺失的人类细胞中siRNAs小分子并非能诱导产生RNA沉默。

（Doi，2003）不同的是，siRNAs小分子能够在Dicer酶敲除的ES细胞中行使降低靶基因表达的功能。

（Kanellopoulou,2005）

    目前提出两条类似的DrosohailaRISC组装步骤（Pham,2004;Tomari,2004），而Tomari,2005将两条类似途径整合，如图1-1。

Tomari,2004a提出，RISC的组装开始于双链siRNAs小分子整合到未确信的蛋白形成复合体B，在体外，复合体B是RISC装载复合体（RISC-loadingcomplex,RLC;formerly“complexA”）的动力学前体，尽管复合体B作为RISC组装的初期中间体的途径还不是很完整，但RLC在将siRNAs小分子装载到RISC中的关键作用已取得有力支持（Tomari,2004b）。

RLC含有Dcr-2蛋白和它的合作者R2D2蛋白,而后者具有前后相近的dsRNA结合结构域，而这两个蛋白质关于体内的RNA沉默中的RLC的形成及siRNAs小分子解链都是必需的。

（Liu，2003）RLC既含有双链的siRNAs小分子，也含有小量的单链siRNAs小分子，这说明双链siRNAs小分子的解链始于那个复合体。

RLC中的siRNAs小分子通过Dcr-2蛋白和RICS前体（holo-RISC）的Ago蛋白的彼此作用而将RICS前体征募过来形成RISC复合体。

Pham,2004提出的途径与此类似。

RISC功能

  小RNA分子进入RISC复合体后，小RNA分子至少有三种不同的沉默方式。

在RNAi途径中，小RNA分子介导RISC切割靶RNA，RISC的切割需要Mg2+存在，但此反映可被硫代磷酸酯在易断裂的磷酸基团处抑制，切割产物具有5’端磷酸基团、3’端羟基。

该反映被以为是通过Argonaute蛋白的亚家族的Piwi结构域催化的，该结构域是Mg2+依托的RNaseH的结构同系物，而RNaseH切割RNA-DNA杂合体中的RNA链（Song，2003；2004）。

不同于RNaseH，每一个具有切割能力的RISC只在其靶RNA目标的唯一磷酸二酯键处进行断裂（即易断裂的磷酸基团处）（Elbashir，2001）。

RISC是一种多转换酶类（multipleturnoverenzyme），Argonaute蛋白质是RISC中的核心组分。

小RNA分子将RISC引导到靶RNA分子，靶目标被切割后，小RNA分子完封不动地离开RISC（MartinezandTuschl,2004）。

      目前研究说明将RISC绑定到靶RNA分子上的能量来源于小RNA分子5'端（Haley,2004;Doench,2004），这是siRNAs小分子和miRNAs小分子与反义寡核苷酸的本质不同的地方，后者所有的碱基对特异性具有相等的奉献。

倘假设多个小RNA分子结合到靶目标上，siRNAs小分子和miRNAs小分子的3'端与靶RNA分子的完全配对关于翻译抑制及靶mRNA破坏并非是必需的，从技术角度说，绝大多数小RNA分子不但下调它们的目标靶mRNA分子，而且减少其它与小RNA分子有部份互补序列的mRNA分子的表达。

（Jackson,2003）

    在翻译抑抑制途径，小RNA分子介导RISC结合到mRNA分子并抑制其翻译成蛋白质而不是切割mRNA分子。

多细胞动物中的miRNAs小分子主若是，固然并非老是，介导翻译抑制而不是切割它们。

相对而言，大多数植物miRNAs小分子直接指导靶mRNA分子的切割。

在很多详细研究的多细胞动物翻译抑制例子中，翻译抑制是靶mRNA分子的3'端非翻译区位点对小RNA分子指导的RISC结合的反映。

事实上，mRNA分子3'端非翻译区的多个候选结合位点能够作为预测mRNA分子是不是受小RNA分子调控的指示标记。

（Lewis，2003）

    小RNA分子还能够指导抑制性异染色质的形成。

到目前为止，对这条途径相关的唯一复合体的描述是关于Schizosaccharomycespombe的RITS（aRISC–likecomplexthatcontainssiRNA），关于RITS如何指导组蛋白的修饰从而增进抑制性异染色质的形成的机制还不清楚。

小RNA分子通过DNA甲基化而抑制翻译目前在多细胞动物中也有报导。

（Kawasaki，2004）

植物中至少有三种RNA沉默途径（DavidBaulcombe,2004），在这些途径中，沉默信号能够在细胞间扩增及传导，乃至能够通过反馈机制自我调控。

这些途径的不同生物学作用已经成立，包括防御病毒、调控基因表达和与染色质异缩为异染色质有关。

三种途径均包括通过具有RNaseIII结构域的Dicer酶将双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）剪切成21-26ntRNA分子。

这些小RNA分子被称为小干与RNA（shortinterferingRNAs,siRNA）或分子（microRNAs,miRNAs）。

三种途径之一是细胞质siRNA沉默（Hamilton,1999）。

这条途径可能在病毒感染植物细胞中起重要作用，其中dsRNA可能作为复制媒介（replicationintermediate）或具有单链病毒RNA的二级结构特点。

在植物DNA病毒中，dsRNA可能通过重叠互补转录本的退火而形成。

第二个途径是通过miRNAs沉默内源mRNA。

这些miRNAs分子通过与特异mRNA的碱基配对而负调控基因表达，致使RNA剪切或蛋白翻译的停滞。

miRNAs可能来源于具有部份双链区域的反向重复前体RNA分子，它们通过与互补的单链mRNA彼此作用而起作用。

植物中RNA沉默的第三条途径是通过DNA甲基化抑制转录而起作用。

这条途径的最初证据是在植物中发觉转基因及病毒RNA指导特异的核苷酸DNA甲基化（Mette，2000；Jones，2001）。

最近研究发觉植物中siRNA指导的DNA甲基化与组蛋白修饰有关。

（Zilberman，2003）

Rrgonaute（Ago）蛋白质参与RNA沉默的所有三种途径。

拟南芥中，AGO1突变体对细胞质siRNA沉默和miRNAs沉默这两个途径是缺失的，而AGO4突变体那么对染色质沉默途径有所损害。

（Zilberman，2003）AGO蛋白的中心作用可能作为沉默效应复合体（silencingeffectorcomplexes）的成员而发挥作用，而后者结合siRNA和miRNAs分子。

Dicer基因家族在拟南芥中只有四处成员（Schauer，2002），其中的两个成员的功能已取得较好的确信。

DCL1（Dicer-like1）与miRNAs的生物合成有关。

（Papp，2003；Finnegan，2003；Xie，2004）DCL3产生逆转录因子和转座子，与染色质沉默有关。

（Xie，2004）DCL3的产物对应于与一类转座子相关的siRNA，而且产物相关于典型的DCL1产物而言较长（24个核苷酸而不是通常的21个核苷酸）（Hamilton，2002；Tang，2002）家族中的另外两个成员的功能目前尚未取得专门好的鉴定。

在,fungi和植物中，RNA依托的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerases,RDRsorRDRP）在细胞质及染色质沉默途径中发挥作用（Sijen，2001；Smardon，2000；Cogoni，1999；Dalmay，2000）。

拟南芥中沉默转基因和病毒的细胞质RNA沉默途径要求RDR1和RDR6两个直向同源基因，但是这两个蛋白对不同的病毒RNA有特异性，RDR6突变体对黄瓜花叶病毒超灵敏而对烟草花叶病毒并非灵敏（Dalmay，2001），而降低RDR1表达水平的烟草植株表现出对烟草花叶病毒灵敏。

（Xie，2001）

植物和多细胞动物的miRNA途径大体上是一致的；都是由Dicer产生的20-22nt单链miRNAs分子作用，二者都依托于Ago蛋白的作用。

但是多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha和DicerRNaseIII在细胞核及细胞质分两步别离发生的。

（Bartel，2004）而植物中的miRNAs分子只是由Dicer酶加工的，而且可能该步骤只是在细胞核中发生。

（Papp，2003）与这两种加工形式不同相对应的是，一种dsRNA结合蛋白，HYL1，只对植物miRNA途径特异。

（Han，2004；Vazquez，2004）二者更要紧的不同点在于：

植物的miRNA分子与它们的靶RNA分子完美配对而且用RNA剪切而不是翻译抑制（translationsuppression）作为要紧的沉默机制。

（Rhoades,2002;Jones-Rhoades,2004;Llave,2002）动物的miRNA分子一般是靶向到mRNA分子的3’非翻译区（untranslatedregin,UTR）,而植物miRNA分子那么是靶向到编码区乃至在5’非翻译区。

（Sunkar，2005）

转录后基因沉默（PTGS，post-transcriptionalgenesilencing）-最初被以为仅限于矮牵牛花和其它一些植物中的奇异现象，是目前分子生物学研究中一个最热点的话题。

过去几年中，科研工作者已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动、植物中，在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要作用。

可是最兴奋人心的是转录后基因沉默现象的技术应用，即在多种有机体中应用核糖核酸干扰（RNAinterfere,RNAi）技术进行特异性的基因剔除以研究相应的基因功能。

那么核糖核酸干扰现象是如何被发觉？

它是如何工作的？

科研工作者如何把它应用到功能基因组学的研究中呢？

10连年前，RichJorgensan和他的同事在矮牵牛花中发觉一种奇怪的现象。

他们尝试把由一强有力启动子操纵的基因pigment-produing导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果不但颜色未加深，许多花呈现杂色乃至白色。

RichJorgensan把这种现象称为"共抑制"，因为外源性导入基因和内源性具有相似功能基因的表达都被抑制了。

那时人们不明白这是一种转录后基因沉默。

双链核糖核酸能致使转录后基因沉默第一来自于对线虫的研究。

1995年Guo和Kewphues试图用反义核糖核酸来阻断Par-1基因的表达以研究其功能。

确实反义核糖核酸抑制了基因表达，出乎意料的是用作阴性对照的正义核糖核酸也抑制了基因表达。

该结果一直让人迷惑不解，直至三年后Fire和Mello进行了另一实验才真正提出双链核糖核酸能致使转录后基因沉默的理论。

Fire和Mello发觉把反义核糖核酸和正义核糖核酸的混合物导入线虫后，其抑制效应远远强于单独导入反义核糖核酸或正义核糖核酸的抑制效应。

再后来Baulcomb和Hamilton第一发觉是~25nt的核糖核酸能特异性抑制具有相应互补序列的基因表达。

那么核糖核酸干扰（RNAi）是如何工作的呢？

第一外源导入的双链核糖核酸（dsRNA）被切割为21~23nt的小分子干扰核糖核酸（siRNA）。

Dicer,作为特异性核糖核酸酶家族的一个成员，切割双链核糖核酸为19~23nt小分子干扰核糖核酸（siRNA），这是一个依托ATP的耗能进程.切割后的siRNA具有3'两个核苷酸TT突出结尾。

然后siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-inducedsilencingcomplex）。

该复合体依托ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。

活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体，最终致使基因沉默效应。

目前具体的切割机制还不明了，研究说明每一个RISC包括单链siRNA和核糖核酸酶RNase。

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由于RNAi壮大的基因沉默效应，有人提出了RNAi通路的效应扩增问题。

RNAi通路的效应扩增可能是通过细胞复制外源导入的dsRNA或siRNA本身而实现的。

另外，RISC的多次反复利用也能扩增RNAi的基因沉默效应。

科研工作者已开始RNAi效应增强子和效应抑制子的研究，以为RNAi是机体细胞一种强有力的基因调控机制。

可是在哺乳细胞中外源导入大分子dsRNA（>30nt）常常致使非特异性的基因沉默效应，因为它激活了核糖核酸酶RNaseL而致使非特异性的RNA降解。

相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应。

该序列特异性方式超级严格，一个碱基的错配会显著降低基因沉默效应。

因此siRNA能够说明如下，它是一种具有3'两个核苷酸TT突出结尾的21~23nt大小的双链核糖核酸，作为RNAi的中介分子，通过序列互补配对法那么特异性降解目的基因。

siRNA能够经化学合成，比如闻名生物学公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面处于世界领先水平，它们既提供即用型siRNA，也提供标记生物素、荧光素和磷酸等的siRNA更方便监测其抑制特异基因表达的成效

siRNA也能够通过体外转录获取。

它相对廉价，尤其适合于同时合成多个siRNA。

尽治理论上说，任何一个具有3'两个核苷酸TT突出结尾的19~23nt小分子干扰核糖核酸siRNA都具有序列特异性的基因沉默效应，可是由于位置效应，比如某些序列，尤其是调控序列易被蛋白质附着而阻止RISC的抑制效应，因此科研工作者第一合成2~4个siRNA进行预实验以选定作用最正确者。

RNA专家Ambion公司提供通过体外转录获取siRNA的商品化试剂盒，使这一选择进程简单方便。

目前外源注射和转染是转运siRNA到细胞或机体的要紧途经，以后基因沉默效应能够持续数天，同时传至下一代细胞，但终将短时刻内消失，因此，最近许多科研小组开发了siRNA的表达质粒，通过瞬时转染或稳固转染以达到在细胞内不断表达siRNA的目的。

有些质粒是表达小发夹结构RNAs（shRNAs,smallhairpinRNAs）,在细胞内它被加工处置为siRNA样分子，诱导基因沉默。

该质粒是在polyMeraseⅢ启动子和4~5个碱基T转录终止信号中插入shRAN。

由于polyMeraseⅢ的特性，转录常常在第二个T终止，插入序列折叠成step-loop结构并带有3'-UU突出结尾。

该质粒设计是基于线虫、果蝇等中的实验结果，因为其中的基因沉默效应确实是通过step-loop而诱导。

另外一种siRNA表达质粒是把编码正义和反义的siRNA别离受控于各自的polyMeraseⅢ启动子。

两种质粒的基因沉默效应相当。

Invivogen公司和Imgenex公司都有操作简单、作用有效的商品化试剂盒提供。

而GeneTherapySystem公司的siRNA构建试剂盒那么完全采纳了不同的机制。

该试剂盒第一PCR合成目标序列，然后由T7RNA多聚酶进行体外转录，经退火和纯化处置的体外转录dsRNA模板被重组的Dicer酶切割，从而快速、高效地产生大量小分子干扰RNA（siRNAs）。

产生的siRNAs混合物，比单一形式的siRNA更可能致使基因表达沉默。

基于目前的发表文献和一些实验体会，siRNA的设计可遵循以下几点进行1）选择以碱基A或G开始的19~21nt大小的目的mRNA。

因为RNApolyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能有效作用。

2）针对目的mRNA一样选择2~4个不同序列，GC含量为30~50%，幸免四个碱基T或A的持续序列，幸免选择起始MM下游50~100nt、终止MM上游100nt和5'和3'的非编码区域，BLAST检查设计序列的特异性。

3）设计适当的实验对照，比如设计有1~2个碱基错配的序列，或是随机变更siRNA的碱基排列顺序。

RNAi的研究刮起了科学界的风暴，siRNA迅速有效抑制特异基因功能的性质促使科研工作者不断深切完善该领域的研究。

RNAi可能是以后进展基因医治策略的新希望所在。

RNAi技术必将带来功能基因组学的革命

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:

设计，实验和分析siRNA效应

转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或降低同源基因的表达的现象。

这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制（Kettinget.al.,1999;Tabaraet.al.,1999;Jensenet.al.,1999;Ratcliffet.al.,1999）。

在体内，双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）。

这种21—23碱基大小的双链RNA被以为是在哺乳动物细胞中介导RNAi反映的效应物。

    RNAi技术已经被普遍应用于线虫和果蝇中基因功能的鉴定。

通常将体外转录取得的长双链RNA引入这种生物中来诱导RNAi，可是这种方式在哺乳动物细胞中行不通，因为长片断的双链RNA在哺乳动物细胞中诱发强烈的抗病毒反映，致使整体基因表达模式的改变，而非特异的基因沉默反映。

最新的实验说明哺乳动物细胞中导入小分子双链RNA那么可不能引发类似的抗病毒反映，而能够有效的找到特异的目标靶RNA而介导基因沉默。

实验范例

实验说明：

    选择哺乳动物细胞中的3个基因：

GAPDH,c-myc,和一个RNA结合蛋白基因La作为研究的目标靶。

相应的mRNAs序列进行分析来确信siRNA设计方案，进行siRNA制备，选择适合方式检测基因抑制的成效。

依照基因的不同区域，每一个基因别离设计4组不同的siRNAs。

别离转染Hela细胞并检测目标靶基因表达抑制的程度。

siRNA介导的基因表达抑制的程度别离通过mRNA和蛋白表达水平来检测。

    超过一半以上的siRNAs对目的基因的抑制程度超过50%。

siRNAs在目标靶mRNA上不同位置并无显著阻碍siRNA的活性，最有效的GAPDHsiRNA被用于在不同哺乳动物细胞类型中评估siRNA的活力。

转录方式制备的siRNA被证明是一种性价比高的方式，通过酶的方式制备的siRNAs至少比化学合成的siRNAs有效10倍。

siRNAs的设计：

siRNAs的设计依照Elbashiret.al.（2001）描述的方式，带3’突出的两个U。

候选的siRNAs序列别离位于mRNA靶的3’5’和中部，从而验证不同的区域是不是对siRNA介导的降