同步荧光法测量步骤林美娜.docx

同步荧光法测量步骤林美娜.docx

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同步荧光法测量步骤林美娜

同步荧光光度法测定混合溶液浓度

同步荧光法技术是由Lloyd首先提出的，它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。

由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图，称为同步荧光光谱。

操作过程中，对激发波长和发射波长的波长差Delta的设置最为重要。

参数设置完毕后，对混合溶液进行扫描，由于每个混合液浓度均对应一个荧光强度值，根据浓度和荧光强度的线性关系绘制标准曲线，待测物只需按相同方法扫出其荧光强度，内插即可获得浓度值。

具体步骤如下：

（1）Delta的选取（可查阅相关文献，也可根据实验获得）

（2）激发波长范围的选取（根据溶液本身性质）

（3）扫描，获得同步荧光光谱图

（4）配置不同浓度混合溶液，根据标准浓度与各自物质特征波长下的荧光强度值绘制标准曲线

（5）对未知浓度进行扫描，获得各个物质特征波长下的荧光强度，求得混合物中各物质浓度。

（1）~（3）具体操作如下：

点击桌面文件夹CaryEclipse，双击Scan

进入下面界面

点击Setup，出现以下界面

点击Synchronous，设置波长差Delta，激发波长范围start和stop。

具体混合物的波长差可通过实验获得，对于L-色氨酸和L-酪氨酸混合物，Delta通常取70nm，波长范围200~350。

设置完毕后点击OK

点击Start开始扫描

获得混合溶液的荧光光谱曲线，两个波峰分别为L-酪氨酸和L-色氨酸的特征峰，其特征波长分别为225.93nm，279.07nm。

（4）标准曲线的绘制

配置浓度1~7μmol/L的混合溶液，扫描后获得波长为225.93nm和279.07nm处的荧光强度。

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为1μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为2μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为3μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为4μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为5μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为6μmol/L时的光谱图

L-色氨酸和L-酪氨酸浓度各自为7μmol/L时的光谱图

根据标准浓度和225.93nm、279.07nm处的荧光强度关系绘制标准曲线，如下图。

（5）未知浓度的测量

按照上面的方法扫描出未知浓度混合液的荧光光谱图，读取其荧光强度值，结合标准曲线，获得相应浓度值。

补充部分：

谱图的处理

（1）谱图的处理（以一阶导数处理为例）

如果需对谱图数据进行处理时，可按如下步骤：

选中需要进行处理的谱图，点击谱图数据处理按钮（如下椭圆形图标），出现如下界面

点击“SelectedTrace”，即选中所需处理的曲线，在Operation中选取所需处理的方法。

处理方法

处理方法选中完毕后，例如一阶导数Derivl，点击“Apply”，出现如下界面

再对DisplayOptions进行选择，是绘制新谱图还是跟原数据绘制在同一张谱图上，然后点击“=”，即出现经一阶导数处理后的谱图。

（2）数据的获得

点击Createreport，出现如下界面

波长与特征峰值

所有波长下的荧光强度值

如果选中X-YPairstable，即可获得所有波长下的荧光强度值，如下