FCM对外周白细胞的免疫荧光分析.docx

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FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

    外周血是临床检验中的重要标本。

FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。

这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。

近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现

    　　　　外周血是临床检验中的重要标本。

FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。

这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。

近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息，这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。

本节　主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。

一、白细胞的免疫荧光标记技术1．白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表10-2）。

表10-2　WHO对白细胞分化抗原的命名

    抗原分子量单克隆抗体反应阳性细胞

    CD1P45/12Leu6,T6,OKT6胸腺细胞、朗格罕细胞

    CD2P50Leu5B,T11,OKT11E玫瑰花受体、T和NK细胞

    CD3P19-29Leu4,T3,OKT8T细胞

    CD4P55Leu3,T4,OKT4协助—诱导T细胞，单核细胞

    CD5P67Leu1,T1,T101T细胞、B细胞亚群，慢粒（淋巴性）

    CD6P120T12T细胞

    CD7P41Leu9.3AT，T—ALLa和NK细胞

    CD8P32-33Leu2,T6,OKT8抑制-细胞毒T细胞、NK细胞

    CD9P24BA-2淋巴细胞白血病相关抗原

    CD10P100CALLA,J5粒细胞、前B白血病细胞

    CD11P170/95CR3/Leu15,OKM1单核细胞、粒细胞、NK细胞

    MO1T细胞亚群（C3bi受体）

    CD15LNFP-ILeuM1单核细胞、粒细胞、激活的T细胞

    CD16P50~70Leu11NK细胞、粒细胞（IgGFc受体）

    CD19P95Leu12,B4B、CLLb前B-ALL细胞

    CD20P35Leu16,B1B细胞

    CD21P140CR2,B7B细胞、C3a受体细胞

    CD22P135Leu41B、CLL、和毛细胞白血病细胞

    CD23P45Blast2

    CD24P45，P55BA-1B、CLL和前B-ALL细胞

    CD25P65IL-2受体数分裂因子激活的T细胞HTLV-I、II、感染细胞a：

急性淋巴细胞性白血病；b：

慢性淋巴细胞性白血病。

2．样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液，而且大部分样品都需经荧光染色。

样品的制备方法大致有三种：

①用荧光单克隆抗体染全血，随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色。

（1）全血染色后溶解红细胞：

由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行，这样减少转换过程中的污染。

而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节　省时间。

由于此法未将粒细胞去除，故在用FCM分析时，要注意排除粒细胞的干扰。

具体操作步骤如下：

①全血100～150μl，放入5ml试管，并用50～100μlPBS稀释，总体积为200μl。

]②荧光标记的单克隆抗体染色30min，4℃（或放于冰上）。

单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大，但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用10μl。

注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗。

离心250×g（约每分钟1500转），5min，洗3次。

注意每次用吸管将上清吸出，决不能倾倒去液！

④用2ml氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约10min。

若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。

注意溶解程度的掌握十分重要：

若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。

若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。

这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。

而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

【氯化铵液的配制】　　Tris—氯化铵1×氯化铵　　0.16mol/L　NH4Cl　　0.38g/100ml　　90ml　　0.16mol/L　　NH4Cl　　0.17mol/L　Tris　　2.06g/100ml　　10ml　　0.17mol/l　　Tris　　pH值7.56　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2⑤红细胞被彻底溶解，加入1mlPBS稀释的0.5%甲醛，立即离心，洗3次，条件同步骤③。

加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染。

⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液内。

置4℃，蔽光，等待分析。

经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便。

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：

此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。

但由于有时有些标本比较敏感，溶解红细胞后，还要经过多个染色步骤，这样容易造成抗原的丧失。

此法具体步骤如下：

①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里。

②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

③立即离心100～150×g，并用PBS洗2次。

④白细胞计数，注意存活率应在90%以上。

做成每毫升含5×106白细胞悬浮液。

将细胞分配到5ml的试管，每试管0.2ml，即1×106个细胞。

⑤荧光标记的单克隆抗体染色30min，4℃，避光。

抗体浓度配制如前所述。

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。

方法如前。

（3）用Ficoll—Hypaque梯度离心法分离出单个核细胞：

用此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等。

血液标本应有抗凝剂。

取血到分离不能超过6h。

①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀释。

②稀释血8或40ml置于15或50ml离心管内，4或10mlFicoll—Hypaque（或者等量的其它分离液，比重为1.007）从离心管底部轻轻加入到血的下面。

这种方法对血的扰动较小，比将全血加到Ficoll上面为好。

加完后，可以清楚看到Ficoll与全血之间有一明显的分界线。

注意在Ficoll快加完时应特别小心，否则有可能加入气泡搅混血样，使血与分离液混合，达不到分离的目的。

③离心350～400g,30min。

红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部，中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。

④取出中间层中所有细胞，若在Ficoll中还有细胞也要取出，这也是单个核细胞（PBMC）。

⑤用PBS洗3次，第1次清洗时，可用较快速400×g离心10min。

因为有可能中间层中混有一些ficoll，比重增加而细胞不易沉降。

⑥PBMC计数，注意存活率应高于90%。

配成5×106个/ml的细胞悬浮液。

⑦取出0.2ml的悬浮液加入到5ml试管（内含1×106细胞），用荧光标记的单克隆抗体染色，方法如前。

洗3次后固定。

注意必须先染色后固定，固定后的细胞膜通透性改变，会导致荧光标记的抗体进入细胞中去，而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。

当用FCM分析时，则均为阳性而达不到检验目的。

这也是用FCM分析的细胞存活率应高于90%的原因。

（4）荧光标记抗体的细胞染色：

如前所述，FCM分析被荧光标记的抗体染色的细胞，在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的FCM的激发光谱相匹配。

一般各个公司所采用的绿色荧光染料为FITC，而选用的红色荧光染料却不尽相同，有的用TRITC，有的用藻红蛋白（PE），所需要的激发光谱就不一样，因而若因匹配不当则会招致荧光抗体所染的细胞分析不出来，这是应该注意的。

　　这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。

下面仅说明一些具体的注意事项：

①在用间接法染色时，染色步骤依次为第一抗体→清洗→第二抗体→清洗→红细胞溶解。

为了实验的方便，将第二抗体也配成每次实验用10μl。

②双色法：

双色法多用于直接染色法。

将分别用FITC和PE标记的抗体各10μl置入同一个含有约1×106/0.2ml的试管内，30min，4℃避光。

然后清洗、固定。

　　目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体，分别用红、绿荧光染料标记后，制成一种试剂。

如CD2—FITC/CD20—PE；CD4-FITC/CD8-PE等。

可按说明使用，具体用量为每次实验10μl。

③对照组：

众所周知，免疫组化的染色过程中，阴性和阳性对照是必不可少的。

在准备用FCM分析的细胞时，对照标本的制备显得格外重要。

因为一次用FCM分析的样品可能会很多，甚至多达上百个试管。

对同一病人也可能会用到20～30个不同的单克隆抗体。

每一个病人都要有相应的阴性对照。

阴性对照主要用于仪器分析细胞之前，设立阴性和阳性的分界线。

阳性对照主要用于检查染色方法。

阳性对照细胞选自那些已知的细胞和已知的单克隆抗体中的阳性反应最明显者。

阴性对照细胞有以下几种：

1）非染色细胞：

直接染色法时，用10μlPBS代替与荧光结合的单克隆抗体，其它步骤相同。

间接染色法时，分别用10μl的PBS代替第一抗体和荧光第二抗体，其它步骤相同。

2）使用非特异性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特异性的单克隆抗体。

这是由于所使用的单克隆抗体来自小鼠，可能造成非特异性的假性反应，因此使用MsIg作为对照。

同时还需要注意选择与实验用单克隆抗体亚类一致的MsIg。

如大部分单克隆抗体为IgG1，也有部分抗体为IgM，所以用MsIg作对照组时，往往使用MsIgG和MsIgM两种。

直接染色法时，用10μl与荧光结合的MsIg，代替荧光单克隆抗体。

间接染色时，用10μl无荧光的MsIg代替第一抗体。

其它步骤与实验组相同。

3）双染色对照：

将各10μl的分别与红荧光染料和绿荧光染料结合的MsIgg或MsIgM，加入到同一个试管，代替荧光的特异性单克隆抗体，其它步骤相同。

4）间接法对照：

用10μl的PBS代替第一抗体。

荧光第二抗体的浓度和使用量均与其它实验相同，其它实验步骤也和实验组相同。

二、白细胞免疫荧光分析的数据分析　　在仪器调试和校准及标本制备完毕之后，就要做测试和数据分析工作。

这里先讨论一下有关数据测量和分析的技术问题，而一些医学应用的具体参数的测量和分析后面做介绍。

　　1.0。

散射和90。

散射的双指标的二维图像分析　　可以把0。

和90。

散射分别选作二维图像的X轴和Y轴指标。

通过图中数据点分布把全血分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞几个亚群（图10-9）。

    图中，A、B图的淋巴细胞数大约有6000～9000个；C、D图约有2000～4000个。

分群编号依次表示：

①红细胞、死细胞和渣滓；②淋巴细胞群；③大颗粒淋巴细胞；④单核细胞；⑤粒细胞。

数据是对1000个细胞分析得到的。

　　若用单指标直方图，对PBMC而言，可以把淋巴细胞和单核细胞分开。

见图10-10中的A、B图。

但对红细胞溶解后的全血，单指标图分辨率则不够了（图10-10的C、D图），图A、B给出的是经ficoll后的PBMC；图C、D给出的是人外周血白细胞。

图中数字编号所代表的组分和图10-9相同。

　　由上可见，在分析红细胞溶解后的全血时，必须先采用双指标二维点图。

从图上也可清楚地看出，粒细胞、未被溶解的红细胞和一些渣滓，由于不同的体积和致密度，明显地区别于淋巴细胞和单核细胞从而能把它们分开。

看到清楚的细胞分群以后，可以在计算机的显示屏上将所要分析的细胞画线框出，并通过指令送入存贮器，以后就可只对框出部分做各种数据分析和深入考查。

图10-11就是对双指标点图上的淋巴细胞群框定的示意图。

数字所表示的意思和图10-9相同。

    图10-10　外周血白细胞及PBMC的单指标直方图

    图10-11　双指标点图上细胞的框定2．单维直方图上阴性分界游标设置前面已经强调，在用FCM分析时，阴性对照是必不可少的。

首先用非染色细胞，根据前面介绍的双指标二维点图的办法，将某一细胞群框定；然后分别选用绿色荧光（GFL）和红色荧光（RFL）单指标直方图。

在直方图上所出现的细胞均为阳性。

可用改变GFL和RFL增益的办法，将细胞恰好调节　到左侧并设立游标（图10-12）。

　　然后再测试MsIg染色的阴性对照。

某些细胞，由于膜上的Fc受体可以与对照抗体鼠Ig非特异性结合，因而有一定的背景染色，不过这种阳性百分率不应超过5%。

所以MsIg与非染色细胞的分界游标确立后，以后所测试的标本以此为标准，游标位置基本不变。

    图10-12　阴阳性细胞分界游标的设置　　MsIg的红、绿荧光阴阳性分界游标确立以后，可以测试实验标本。

首先检查细胞分群情况，然后检查淋巴细胞群是否落在已输入计算机的淋巴细胞框定的范围里。

若染色及FCM的工作性能都正常，则框定的位置不会改变。

然后转换成荧光直方图。

若为FITC标记的细胞，则GFL为X轴；若为PE标记的细胞，则用RFL为X轴。

由于阴阳性分界游标记已确立，细胞阳性率及图像均显示于计算机荧光屏上；同时也可选用其它指标和图像、打印所需的资料等。

3．双染色分析游标设立和荧光校正

（1）游标的设立：

游标设立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成。

分别选用GFL和RFL为X和Y轴。

先用不染色细胞测试，将阴性细胞集中在左下角（图10-13）。

分别为X、Y轴设立游标，再用MsIg的阴性对照测试。

可将X、Y轴游标略为移动，使位于窗“3”内的细胞（阴性）在95%以上。

（2）红、绿荧光的校正：

由于红色荧光探测器在最佳测试状态时，会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。

这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长较长。

若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分GRL，就会大大地降低RFL探测器的灵敏度。

因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正，在RFL中适当扣除GRL的影响。

　　　　通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见，图10-14给出CD11-PE（T细胞、RFL）及CD8-FITC（T抑制细胞，GFL）双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图。

X轴为GFL，Y轴为RFL，由X轴Y轴游标划分的四个窗的阴阳性和图10-13相同。

各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比。

图A表示未经校正时的情形。

窗“2”内31.46%表示双阳性细胞，即在T细胞中31.46%为抑制细胞毒细胞。

经过适当校正，可见有两群阳性双标记细胞出现（B图）。

高强度部分为真正的CD8、CD11双标记阳性细胞；低强度部分属于CD8绿色阳性细胞（NK细胞）。

此时“2”窗中细胞份额减为7.59%。

需要指出的是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少（图C）。

　　　　图10-13　双染色二维点图上游标的设置　　1区：

红色荧光阳性；2区　：

红、绿荧光均为阳性；3区：

阴性细胞：

4区：

绿色荧光阳性细胞

    图10-14双染色在二维等高图上荧光校正　　双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。

补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电倍增管PMT1有信号输出外，另一光电倍增管PMT2也常会有微弱输出。

调节　补偿器使PMT2的输出为0；然后再测另一种波长的荧光染料，调PMT１的补偿器使之输出也为0；然后再测另一种波长的荧光的染料，调PMT1的补偿器使之输出也为0：

如此反复调节　，使两种荧光的探测器都获得补偿。

实际调节　时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子。

利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。

需要指出的是：

当PMT高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时，都要对荧光校正做重新补偿调节　。

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义　　淋巴细胞由于表面特异性抗原的差异可分为四大类（表10-3），这些不同抗原表现型的亚群执行不同的机能。

而且某些疾病会选择性地损伤某些亚群而造成亚群之间的比例失调。

根据FCM双荧光分析的结果，现将不同的抗原和不同的机能的淋巴细胞亚群列于表10-4。

表10-13主要淋巴细胞亚群的表面抗原

    细胞表面抗原的类型

    抗原表现的细胞

    T协助、诱导细胞

    T抑制、T细胞毒细胞

    NK细胞

    B细胞

    独特的

    CD3（Leu4）

    ＋

    ＋

    －

    －

    CD4（Leu3）

    ＋

    －

    －

    －

    CD8（Leu2）

    －

    ＋

    －／＋

    －

    CD16（Leu11）

    －

    －

    ＋

    －

    CD19（Leu12）

    －

    －

    －

    ＋

    限制性的

    Leu7

    －／＋

    －／＋

    ＋／－

    －

    Leu8

    ＋／－

    ＋／－

    －／＋

    ＋／－

    CD7（Leu9）

    ＋／－

    ＋

    ＋／－

    －

    CD11（Leu15CR3）

    －／＋

    －／＋

    ＋

    －＋：

表现的抗原；－：

未表现的抗原；＋／－：

主要亚群有表现的抗原；－／＋：

抗原仅表现于少数亚群。

表10－14　淋巴细胞机能性亚群

    细胞群

    细胞机能

    测试的单克隆抗体

    T细胞

    协助细胞

    Leu3+8-

    抑制细胞—诱导细胞

    Leu3+8+

    细胞毒细胞

    Leu2+15-

    抑制细胞

    Leu2+15-

    抑制作用

    抑制—诱导细胞

    Leu3+8+

    抑制--增强细胞

    Leu2+8-

    抑制—增强细胞（激活）

    Leu2+8-DR+

    抑制—效应细胞

    Leu2+8+15+

    组织相容限制的细胞毒性细胞

    第一类限制性

    Leu2+15-DR-（7+?

）

    第二类限制性

    Leu3+

    第二类反应性

    Leu2+

    非组织相容性限制的细胞毒细胞

    NK亚群

    Leu7+11+15+

    Leu7-11+15+

    Leu7-11+DR+

    B细胞

    Leu12+14+16+DR+

    CR2+k+或λ+

    亚群

    Leu12+1+

    Leu12+1-　　外周血白细胞的机能，特别是淋巴细胞的机能状态在一定程度上反应了机体的免疫机能。

近几年来，用FCM来测定某些疾病的淋巴细胞及其亚群已成为重要的诊断和预后判断的指标，如对骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的诊断和对免疫缺陷病的估价等。

测定淋巴细胞亚群的主要依据是在于淋巴细胞表面不同的抗原表现型，而这些表现型又依赖于相应的单克隆抗体而被识别。

所以，特异性很高的单克隆抗体结合先进的FCM，已为临床提供了不少非常有用而重要的资料，但被FCM所分析的淋巴细胞的整个临床意义尚未完全认识清楚。

随着更多确定淋巴细胞表现型的试剂的应用，FCM对诊断和治疗计划的拟定以及预后的估计将会表现出更重要的实用意义。

1．T淋巴细胞亚群的测定如前所述，在使用FCM分析时，先用0。

散射和90。

光散射双指标将白细胞分为三群：

淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

在二维点图上划出淋巴细胞群范围后，设立GFL的RFL单指标的直方图。

命电子计算机仅计数所输入的淋巴细胞，即划线框出的那部分细胞。

一般计数输入的细胞可设1000～5000个。

直方图的分析可显示阳性细胞的百分率。

应用输入细胞数、阳性细胞百分数以及白细胞分类计数，就能得到阳性细胞的绝对值，即每立方毫米血液中的绝对值。

有时T淋巴细胞某亚群的绝对值比百分率更为重要，因为它可以表明T细胞某亚群的增高和减少。

当然，淋巴细胞占白细胞的百分数也是一个重要数据，应当准确测出。

　　CD4/CD8细胞的比值，有时也用于反映病人淋巴系统的机能状态。

不少临床免疫实验室已把CD4/CD8的值作为常规血检查的项目。

在国际上，淋巴细胞亚群以及CD4/CD8并未建立统一数值，各实验室均需建立自己的标准。

平均值一般为1.73～2.00。

　　一般而言，影响淋巴细胞亚群的因素较多，如年龄、性别、种族、以及外周围环境如季节　、药品等的影响。

T细胞的绝对值在儿童略高于成人。

婴儿CD4细胞的百分率较成年人高；老年人的CD8略低。

正常人在一昼夜内也有周期性的波动：

上午CD4略低，下午4时之后开始增加，直至次晨，平均波动为15%～20%。

尽管正常情况下淋巴细胞亚群有所变动，但仍属正常范围。

某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴细胞肿瘤，其淋巴细胞亚群及其比值测量结果均可能偏离正常范围。

　　有工作报道，传统的T辅助诱导细胞（CD4+）具有抑制机能，而在T抑制细胞毒细胞（CD4+）中，有些又具有协助的功能。

因此，对原来设想的CD4、CD8的机能分群有所混淆。

预计会有新的单克隆抗体再从CD4和CD8的细胞中分出。

不过就目前看来，不少临床免疫实验室已用CD4/CD8比值结合淋巴细胞绝对值对多种疾病的诊断、治疗和预后的估计提供了不少有价值的资料。

2．艾滋病以及H