实验一光学显微镜地使用与微生物观察.docx

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实验一光学显微镜地使用与微生物观察

实验一光学显微镜的使用与微生物观察

第一节普通光学显微镜的使用

一、实验目的

1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。

2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。

3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。

二、基本原理

（一）普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。

1、机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。

（1）镜座：

它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。

（2）镜臂：

用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。

（3）镜筒：

它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。

镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。

镜筒长度一般固定，通常是160mm。

有些显微镜的镜筒长度可以调节。

（4）物镜转换器：

它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。

为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。

转动物镜转换器可以选用合适的物镜。

转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：

载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。

载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。

有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。

（6）调节器：

调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。

粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。

图1-1 普通光学显微镜的构造

1.镜座  2.镜臂   3.镜筒    4.转换器   5.载物台  6.压片夹7.标本移动器   8.粗调螺旋   9.细调螺旋  10.目镜11.物镜 12.虹彩光阑（光圈） 13.聚光器   14.反光镜

2、光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。

（1）目镜：

它的功能是把物镜放大的物像再次放大。

目镜一般由两块透镜组成。

上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。

在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。

由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。

标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。

在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。

目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。

可按需选用。

（2）物镜：

它的功能是把标本放大，产生物像。

物镜可分为低倍镜（4或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40～60×）和油镜（100×）。

一般油镜上刻有“OI”（oilimmersion）或HI（homogeneousimmersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。

物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numericalaperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。

以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。

图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数

（3）聚光器：

聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。

聚光器安装在镜台下，可上下移动。

使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。

聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。

在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。

图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系

（4）反光镜：

它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。

反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。

反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。

一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。

（二）普通光学显微镜的性能

1、数值孔径

数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。

               （1-1）

式中，n为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。

物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。

因为镜口角总是小于180˚，所以sin

的最大值不可能超过1。

又因为空气的折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。

根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。

使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4。

图1-4 物镜的镜口角                 　　图1-5介质折射率对光线通路的影响

2、分辨率

分辨率是指分辨物像细微结构的能力。

分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。

D值愈小，分辨率愈高。

（1-2）

式中，λ为光波波长。

比较式1-1和式1-2可知，D可表示为：

               （1-3）

根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。

要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：

①采用短波光源。

普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400～700nm。

缩短照明光源的波长可以降低D值，提高物镜分辨率。

②加大物镜数值孔径。

提高镜口角或提高介质折射率n，都能提高物镜分辨率。

若用可见光作为光源（平均波长为550nm），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辨出的两点距离约为0.22μm。

3、放大率

普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。

采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大（图1-6）。

所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。

因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V1）和目镜放大倍数（V2）的乘积，即：

V=V1×V2           （1-4）

如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。

常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。

图1-6普通光学显微镜的成像原理

4、焦深

一般将焦点所处的像面称为焦平面。

在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。

物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。

因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。

三、实验器材

1、仪器显微镜；

2、材料？

标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

四、实验程序

（一）显微镜（油镜）操作

1、领取并检查显微镜：

按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。

从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移（图1-7），轻轻放置在实验台上（图1-8），检查各部件是否齐全，镜头是否清洁，有问题及时报告老师。

 图1-7显微镜的搬动           　　　图1-8显微镜的放置

光源：

良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。

将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。

然后，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。

3、低倍镜观察：

使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。

将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央（图1-9），用压片夹固定（图1-10），并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋（图1-11），使镜头与标本的距离降到10mm左右。

然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋（图1-12），继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察（图1-13）。

图1-9将载玻片标本置于载物台中央    图1-10用压片夹固定载玻片标本

图1-11转动粗调螺旋     图1-12转动细调螺旋       图1-13转换物镜

4、中、高倍镜观察：

依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。

找出所需目标，将其移至视野中央。

5、油镜观察：

将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。

如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。

可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，击碎玻片，损坏镜头。

6、调换标本：

观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。

7、用后复原：

观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。

降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。

降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。

使反光镜垂直于镜座，以防受损。

将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜内。

第二节微生物形态观察

一、仪器和材料

1、显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。

2、示范片：

大肠杆菌（杆状）、小球菌（球状）、硫酸盐还原菌（弧形）、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。

二、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。

2、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。

3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。

问题与思考

1、使用显微镜的油镜时，为什么必须使用镜头油？

2、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？

实验二培养基的配制

一、实验目的

1.学习制备培养基的基本技术。

2.制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。

二、实验基本原理

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。

培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。

它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；

（1）适当组分和比例的营养物质；

（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。

所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。

培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。

培养基的种类：

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：

合成培养基：

由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：

由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：

利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：

不加凝固剂的液态状培养基。

固体培养基：

在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。

半固体培养基：

在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。

微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。

它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。

琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。

是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。

牛肉膏蛋白培养基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料与仪器

1.试剂牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。

2.其它：

试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。

四、实验步骤

1.称量根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

2.溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。

加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。

溶好后，补足所需水分。

3.调PH用1mol/LNaOH或1mol/LHCl把PH调至所需范围。

4.过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

5.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2（图1）。

分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3）半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

图1灭菌的试管培养基趁热摆成斜面

6.加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

7.包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

8.保存灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。

问题与思考：

1．培养基配制时应注意什么问题？

为什么？

2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？

3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？

实验三消毒和灭菌

一、实验目的

了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理

灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。

消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生物）。

消毒实际上是部分灭菌。

在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

灭菌的方法，通常可以分为四大类：

（1）加热灭菌：

包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；

（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。

在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。

因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

一般培养基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.

三、材料与仪器

吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。

四、实验步骤

（一）干热灭菌法适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。

培养基不适用。

1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。

2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。

3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。

4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。

（二）高压蒸汽灭菌

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。

加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

3．用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

注意：

当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。

5．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。

问题与思考

1．干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？

2．为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？

3．高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？

实验四、微生物接种技术

一、实验目的

1.掌握微生物各种接种方法。

2.掌握无菌操作的基本环节。

二、实验原理

在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。

因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。

将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。

在接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。

三、材料与仪器

（一）菌种

大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌

（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。

（三）接种环、接种针、接种钩。

镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。

四、实验步骤

1．接种前的准备工作

（1）检查接种工具。

（2）在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接咱的菌名、操作者、接种日期等。

（3）将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。

2．接种方法

（1）试管接种方法

①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。

②置试管口于酒精火焰附近；

③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。

④用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。

⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。

⑥重新塞上棉塞。

⑦烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。

（2）试管菌种接到平板培养基的方法

①左手持平板和试管菌种，右手松动试管试管棉塞，烧接种工具。

②右手小指与四指取下棉塞，取菌，打开平皿。

③将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。

④酒精灯火焰上烧接种工具灭菌

⑤棉塞过火，重新塞上试管。

3.培养

1）将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。

2）将接种分离后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒温箱内，酵母菌培养48h，霉菌培养72h后观察。

3）平板培养基置于恒温箱内倒置培养。

问题与思考

1．为什么从事微生物实验工作的最基本要求是无菌操作？

2．大肠杆菌接种于葡萄糖肉汤培养基内培养24小时后，会出现什么情况？

实验五、细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

Ⅰ、细菌简单染色法

一、实验原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。

例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC）；它可被电离成正、负离子：

MBCmethylenebluechloride-

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。

常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystalviolet）、碱性复红（basicfuchsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

染色前必须先固定细菌，其目的有二：

一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

二、实验器材

1、 菌种巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）或蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）；

2、 仪器显微镜；

3、 材料接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水纸；

4、 染料草酸铵结晶紫或石碳酸复红。

三、操作步骤

1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2、干燥将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。

3、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。

待玻片冷却后，再加染料；

4、染色玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）结晶紫染色液（或石炭酸复红液）于菌膜部位，染l-2min。

5、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分（注意勿擦去菌体）。

7、镜检用油