分子生物学实验Word格式.docx

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微量移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置（俗称枪），基本原理是依靠装置内活塞的上下移动，气活塞的移动距离是由调节轮控制螺杆结构实现的，推动按钮带动推动杆使活塞向下移动，排除活塞腔内的气体。

松手后，活塞在复位弹簧的作用下恢复原位，从而完成一次吸液过程。

实验步骤：

1、设定好移液器的读数（1µ

l，5µ

l，10µ

l），按到第一档，垂直进入液面下几毫米；

2、缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少；

3、将液体缓慢点在做好标记的滤纸片上，操作时先按到第一档，稍微停顿1sec后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。

读数的设定：

P10 

0.5~10；

P20 

2~20；

P100 

20~100；

P200 

50~200；

P1000 

200~1,000；

P5000 

1,000~5,000。

图1：

微量移液器的使用方法

思考题：

1.要取265µ

ldH2O，请问如何选择移液器？

第二部分实验蓝色白色菌落筛选重组子

E.coli总DNA

BamHI酶切，回收片段

质粒

T4连接酶连接

转化大肠杆菌细胞

蓝色白色菌落筛选

图2：

第二部分实验总设计图

实验二质粒（pBlueScriptIISK）DNA的碱法提取

实验目的：

掌握质粒小量碱法抽提的基本原理和基本步骤。

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

（在实验前一天晚上，由杨老师在5mlLB培养基中接种大肠杆菌单菌落培养）。

1、取3ml培养物倒入微量离心管中，12000rpm离心1min，尽量去除上清液。

2、将细菌沉淀悬浮于100μl溶液I中，充分混匀。

3、加200μl溶液II（新鲜配制），盖紧管口，轻轻颠倒试管数次，混匀样品。

4、加入150μl溶液III，盖紧管口，迅速颠倒数次混匀，12000rpm，离心5min，将上清转至另一离心管中。

5、向上清中加入等体氯仿（Caution：

氯仿对移液器有很强的腐蚀作用。

），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中（Note：

考虑酚有挥发性，且毒性大，在这不用）。

6、向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后-20℃放置30min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体。

7、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，颠倒数次混匀并12000rpm离心1min，去除上清，用枪头将剩余液体尽量吸干，然后打开离心管的盖子，让样品在37℃培养箱中自然风干（Caution：

乙醇一定要去除干净，因为它会在以后的操作中影响酶的活性）。

8、加25μlTE缓冲液（其中含有20μg/ml的胰RNA酶），充分溶解DNA。

样品放入-20°

C冰箱保存待用。

附1.各溶液的配方：

溶液I：

50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II：

0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III：

3M醋酸钾/2M醋酸

1.碱法抽提质粒时，NaOH的作用是什么？

掌握细菌基因组DNA抽提的方法。

制备DNA的过程中是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是通过SDS和蛋白酶K裂解细胞并消化蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

细菌基因组DNA通常是个很大的环状DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；

另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。

（在实验前一天晚上，接E.coliDH5alpha到LB培养基中培养。

）1、10000rpm离心3min收集3ml新鲜的菌体（两次离心），尽量去除上清。

2、沉淀中加破菌缓冲液300μl（200mMTris-HCl（PH8.0），250mMNaCl，25mMEDTA，0.05g/LSDS；

可以不用溶菌酶、与蛋白酶K），然后60℃，1hr温育，每隔一段时间拿出来轻弹一下，使样品混合均匀。

3、-20℃预冷5min，12000rpm离心10min。

4、取上清液加等体积饱合酚混匀，12000rpm，5min离心取上清液。

5、上清液再加等体积饱合酚：

氯仿＝1：

1混匀，12000rpm离心5min，取上清液。

（Note：

4-5步骤，因为酚有毒，本实验考虑只是提取总DNA，对其纯度要求不高，可以考虑不用做这两步。

）6、将上清液转移到一个新的小离心管中，加等体积氯仿混匀，12000rpm，5min离心，将上清液转移到一个新的小离心管中。

7、向上清中加入2倍体积无水乙醇，并加3MNaAc（pH5.2）90μl混匀，-20℃预冷30min，12000rpm离心10min，弃上清，吸干离心管中的液体。

8.用1ml70％乙醇重悬沉淀，12000rpm，5min离心后尽量去除上清，然后打开离心管的盖子，让样品在37℃培养箱中自然风干（Caution：

9.将干燥好的DNA样品溶于25μl的TE。

1.用本方法抽提的总DNA是否是完整的E.coli基因组，为什么？

掌握DNA酶切方法和琼脂糖凝胶电泳的原理和操作要点。

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

BamHI的识别位点是：

5‘-G↓GATCC-3’

3‘-CCTAG↑G-5’

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是它兼有“分子筛”和“电荷效应”的双重作用。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，长度相同的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

同时，琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

1、在灭菌的微量离心管中依次添加以下样品，混匀后放入37°

C培养箱中保温2-3hr。

dH2O12μl

DNA15μl

10XBuffer3μl

BamHI1μl

总反应体系30μl。

2、称取0.7克琼脂糖，加入100mlTAE缓冲液，微波炉加热溶解（注意此处应该不能看到颗粒物质，在溶液中，一般应沸腾三次），制备0.7%琼脂糖凝胶。

3、待琼脂糖凝胶不烫手时，加入7μl的goldenview（Caution：

该染料可能对人体有害）。

4、封好胶板，插入梳子，制备凝胶。

5、将5μlDNA样品与1μlloadingBuffer（上样缓冲液）混合，加入到点样孔中，在最后一个孔中加入分子量标记（marker）。

6、80V稳压电泳，直至溴酚蓝泳动到离上样孔约2-3cm的位置。

7、带上手套，将胶放入到紫外灯（360nm或254nm）下观察电泳结果，并照相记录实验结果（Caution：

UV有诱变作用。

）。

图3：

琼脂糖凝胶的制备和样品的loading。

B．

A．

8kb

10kb

图4：

A.λ-EcoT14分子量标记的带型图；

B.电泳图的标注方式。

1.为什么未酶切的质粒样品会出现2-3条带？

2.上样缓冲液的作用是什么？

掌握乙醇沉淀和胶回收两种不同的DNA回收方法。

利用融胶液断裂琼脂糖的多糖键，从而使凝胶完全融化，同时采用了硅胶膜特异性吸附DNA，使DNA结合到纯化柱上同时在一定条件下又能被充分洗脱下来，从而实现DNA的快速纯化。

1、制备回收用的琼脂糖凝胶。

2、将待纯化的DNA样品（质粒酶切后的样品）加到胶上进行电泳。

3、在紫外灯下用干净的刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶条（速度要快，UV有打断DNA的作用），将其装入离心管中，估计其体积。

4、加入3倍凝胶体积的BufferDE-A。

5、悬浮均匀后于75°

C加热8min，每隔2~3min混合一次，直至凝胶块完全融化。

6、按BufferDE-A体积的50%加入BufferDE-B，混合均匀。

7、将DNA-prepTube置于2mlMicrofugeTube中，将步骤6中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。

8、弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。

9、弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW2，5500rpm离心1min，弃滤液，以同样的方法再用500μlBufferW2洗涤一次。

10、弃滤液，将DNA-prepTube置于原2mlMicrofugeTube中，12000rpm离心1min

11、将DNA-prepTube置于一洁净的1.5mlMicrofugeTube中，在silica膜中央加入15μldH2O，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA，收集离心后的洗脱液。

1.为什么DNA需要回收？

2.回收胶和检测胶有什么不一样？

了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

所谓感受态是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，该生长阶段的细菌能接受外源DNA而不将其降解。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，形成的机理有两种假说：

1.局部原生质体化假说：

细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞；

2.酶受体假说：

感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法等，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。

1、取出保存的大肠杆菌DH5α菌株在LB平板上划线，置37°

C过夜培养；

2、挑取一活化好的DH5α单菌落至盛有50mlLB液体培养基的三角瓶中；

3、37°

C、300rpm摇床培养3hr，使其OD600=0.6~0.8；

（预实验）

4、将培养好的菌液分装到无菌1.5ml离心管中，冰上放置10min，于4°

C，4000rpm离心4min收集菌体；

5、弃上清，加入1.5ml0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体，轻轻摇匀，置冰上放置30min；

6、再次4000rpm离心4min收集菌体；

7、弃上清，加入200μl0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体，摇匀后置冰上或冰箱中放置待用。

*在整个过程中注意无菌操作。

1.感受态制备中的技术要点有哪些？

了解重组子构建的方法并掌握大肠杆菌转化的方法。

T4DNA连接酶（T4DNALigase）可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。

转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化过程中，受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。

1.将经BamHI处理过的pBlueScriptIISK质粒和回收的目的DNA片段进行连接

线性质粒2μl

目的DNA片段6.5μl

10X连接Buffer1μl

T4DNA连接酶0.5μl

总体积10μl，16°

C水浴,反应过夜。

2、将酶连产物用无菌枪头加入到100μl感受态细胞悬液中，轻轻旋转混匀，冰上放置30min；

3、将上述离心管置于42°

C热激60sec后立即冰上放置2-3min；

4、向离心管中加入0.8mlLB培养基，然后置37°

C摇床180rpm复苏45~60min；

5、样品在4000rpm离心2min，去掉700μl上清，然后将剩下的样品混匀并涂布于添加有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上。

6、平板在37°

C倒置培养14~18hr后观察结果。

附1：

X-gal/IPTG平板的制备

在事先制备好的含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板表面加40μlX-gal（20㎎/ml）储藏液，和4μlIPTG（200㎎/ml），用无菌推子涂匀，置于37℃3-4小时，使液体被充分吸收，备用。

1.经过BamHI酶切的pBlueScriptIISK质粒片段和BamHI酶切的大肠杆菌基因组片段混合后，用T4DNA连接酶进行连接时可以发生哪几种方式的连接，哪种方式占主导？

2.

了解alpha-互补的原理，掌握重组率的计算方法。

蓝白斑筛选的基因工程大肠杆菌菌株为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。

用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'

的基因，lacz'

中包括：

一段β-半乳糖苷酶的启动子；

编码α肽链的区段；

一个多克隆位点（MCS）。

MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。

虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'

的质粒后，质粒lacz'

基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。

1、计算平板上的总菌落数。

2、计算平板上的白色菌落数。

3、计算重组效率。

设计创新实验

实验九：

PCR扩增目的DNA

掌握PCR过程中引物的设计，PCR体系的设定，以及PCR产物的检测。

引物设计的原理：

以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。

按5’→3’方向，照抄模板的序列，先写下5’端引物的序列；

然后根据模板3’的序列，写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列，即为3’引物的序列。

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；

产物不能形成二级结构；

引物长度一般在15~30碱基之间；

G+C含量在40%~60%之间；

碱基要随机分布；

引物5′端可以修饰；

引物3′端不可修饰。

实验过程：

1）根据下面给出的pBlueScriptIISK质粒DNA序列，8个同学一组，自己设计引物，

2）送公司合成引物。

3）设定PCR体系，扩增目的DNA序列。

4）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

PCR的原理和反应体系：

图5：

PCR的基本原理

反应体系：

forward引物（10µ

M）20pmol

reverse引物（10µ

dNTP（2.5mM）4µ

l

10XBuffer5µ

Template0.1-2µ

g

TaqDNA聚合酶2.5U

dH2Otototalvolume50µ

附2：

pBlueScriptIISK质粒的序列：

1cacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcag

61ctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagac

121cgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtgga

181ctccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatc

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