乙型肝炎病毒基因检测方法研究.docx

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乙型肝炎病毒基因检测方法研究

乙型肝炎病毒基因检测方法研究

中华临床新医学ckneseChmc~NewM~cine2005年第5卷第9期819

?

临床研究?

乙型肝炎病毒基因检测方法研究

杨建林薛宝莲

【中圈分类号】12.62【文献标识码】B【文章编号】168o一9866（2O05）一o9—0819—02

摘要目的建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒（HBv）基因变异的方法.方法根据HBV基因序列,用巢式聚合

酶链反应（nest~PCR）分别扩增HBVP基因B区和前c区片段,产物用Apau,SSP1,~U361酶切,30%Acr胶电泳,分析酶切产物片段

长度,建立检测P基因与前c基因变异的方法,对5O例慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者检测YMDD和前c区基因序列变异.结果所

建的nestedPCR方法操作简便,快速,结果准确,经济成本低,灵敏度高,可检测到103拷贝/mI的HBV—DNA.50例慢乙肝患者中,

单纯YMDD变异的32例,合并前c变异的4例.20例健康体检者,血清作为阴性对照.结论本方法简便准确,适合较大样本检

测,可用于临床常见拉米夫定耐药性HBvP基因变异与前C区基因变异的筛检.

关键词乙型肝炎病毒;变异基因;变异基因检测

为建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒基因变异的方

法,笔者根据其基因序列,用巢式聚合酶链反应的方法,分别扩

增其B区和前c区片断.分析其酶切产物片断长度,并用此方

法对5o例慢性乙肝患者进行检测.结果证实,本方法简便,准

确,灵敏度高,适合较大样本检测.报告如下.

1对象和方法

1.1血清标本来源所有标本均来自我院就诊的患者,男32

例,女18例,年龄16—46岁,用拉米夫定6个月一3a,变异基因

的血清标本均一加℃保存.变异基因的阳性血清标本来自北京

佑安医院肝病研究所.

1.2试剂来源及方法乙肝五项:

试剂来源于上海荣盛生物技

术有限公司,用酶联免疫法检测.

珊V—DNA:

试剂来源于深圳市匹基生物工程股份有限公

司,用荧光定量分析法检测.

变异基因:

患者在未用拉米夫定时检测一次乙肝五项和

哪V—DNA,如,抗一HBe,HBV—DNA阳性,HBeAg阴性的

标本和HBV—DNA阳阳,符合用拉米夫定的开始用拉米夫定治

疗,不定期检测HBV—DNA,如HBV—DNA由治疗前的阳性,治疗

后由阴性转变为阳性,选择后一次的阳性标本,如治疗后}玎Bv—

DNA一直仍阳性,选择治疗前与治疗后最后一次阳性标本.

1.2.1试剂来源所有试剂均由北京佑安医院肝病研究所提供.

1.2.2PCR所用引物序列见表1.

衰1PCR所用引物序列

引物

Sl

S2

s4

引物序列

5一ⅡC,C~C顷CCC一3

5一CATC兀’G兀,口rAC】1AC】1G一3

5一Grr（:

AAATcTATACCCAAAGC一3

5一GqV,GCA~CTCAGTCCGTrI℃TC一3

1.2.3变异基因检测万法1O血清加5O裂解液,95℃汽浴

15rnin,120or/rnin离心2rnin,弃去上清液,沉淀物用于PCR.扩

增模板.

1.2.3.1MDD基因扩增与前c区基因P（扩增先用引

物1（S1）,引物2（）作PCR扩增.

Sl,各1.5,10*Bur3,DNTP2.,Taq—E0.8,反

应总体积为31.循环参数:

94℃300s预变性,94℃30s,55℃

45s72℃30s,共循环35圈.72℃延伸420s.

1.2.3.2前C区基因PCR.扩增引物3（S3）,引物49（sd）各

1.5,其余成分不变,循环参数:

94℃60os预变性,94℃3os,55%

30s,72℃6os,共循环35圈.72℃延伸420s.

1.2.3.3前c区扩增产物的酶切BS~614U,BsA0.2,1O*

作者单位:

017000内蒙古鄂尔多斯市第二人民医院

Bur2,}{2014,混匀后每份分装16,取PCR2扩增产物4.

37℃水浴1h.

YMDD扩增产物的酶切,Apa1l3.5U/份,1O*Bur2U1,BSA

0.2,014.或sSp14u,10*Bur2,014.混匀后每

份分装16,取PCR.扩增产物4,37℃水浴1h.

酶切产物经30%Act（由亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺配

制）电泳1h,溴化乙淀染色5—1Ornin,紫外线分析仪上观察电泳

条带.

2结果

2.1变异株的鉴定ⅥDD出现171b~NA条带为野毒株,l49

bpDNA条带为变异株.YVDD出现315bpDNA条带为野毒株,

283bpDNA条带为变异株.前C区基因出现110bpDNA条带为野

毒株,~bpDNA条带为变异株.

2.2敏感性对不同HBV—DNA含量的血清标本进行巢式

PCR扩增,可检测到含量为103拷贝/mI的样本,表明巢式PCR

具有较高的敏感性.

2.3方法的重复性以上标本20例进行2次检测,结果均能

重复.

2.450倒检测样本结果单纯YVDD变异的23例（46%）,ⅥDD

变异的22例（44%）,前c区基因变异的1O例（加%）,YVDD与

ⅥDD同时变异的18例（36%）,YVDD合并前c区变异的5例

（10%）,Y1DD合并前c区变异的5例（10%）,三者同时变异的4

例（8%）.加例阴性对照者检测的三项变异指标均为阴性.

3讨论

近年来发现HBV可出现多种变异,可使HBV感染后,HBV

感染标志物不典型,变异后可加重病情,或出现耐药或免疫逃疫

现象,给诊断和治疗及预防造成困难,因而HBV变异的研究对

了解发病机理,病理判断,诊断,治疗及预后均有关系.

3.1前c区变异由于AA28的变异,使HBe艟不能产生或合

成障碍,而c蛋白仍能产生,患者表现为血清HBsAg,抗一HBe

及HBV—DNA阳性,HBeAg阴性,常表现为进展性肝病及肝功能

衰竭.

3.2P区基因变异P区编码DNA聚合酶,对HBV复制起重

要作用,此区发生突变,则可能导致HBV复制改变或阻断.近

年来,抗HBV药物核苷类似物拉米夫定等的应用,亦发现HBV

变异,拉米夫定是一种非常强的抗病毒药物,其主要作用靶

HBV聚合酶,为其作用的主区,分为A,B,c,D,E5个活性区,其

中A,B,c为三磷酸核苷结合的催化位点,B,E区可能参与RNA

模板和启动子定位.C区包括YMW基因域,为酶催化的活性部

位,其中在逆转录病毒最多的变异是YM叻中的M变异如

YVDD或Ⅵ叻.文献报道,MDO变异最早可发生在治疗后2周

820中华临床新医学ChineseClinicalNewMedicine2005年第5卷第9期

内,一般发生在治疗后9个月（4%）,1a（16%一32%）,2a

（38%）,3a（57%）,4a（67%）.体外实验也证实,一旦出现YM.

DD基因序列变异,HBV对拉米夫定敏感性明显降低.因此,临

床在长期用药过程中,开展HBVP基因耐药性变异检测,以指

导临床及时调整治疗方案,准确,合理用药,提高疗效.

目前检测HBV耐药性基因变异的方法很多,但是不是操作

复杂,就是成本或仪器,设备昂贵,具有局限性.本方法操作简

便,整个检测过程仅需10h,灵敏度高,能检测到1拷贝/

mlHBV—DNA,结果准确,成本低.无需特殊仪器,凡能进行

牛e牛搴牛e牛牛亭牛e牛牛e牛e,卜e牛e

PCR检测的实验室均能开展,是一种很好的检测方法,值得推广

应用.

参考文献

1.陆志檬,等.病毒性疾病诊疗新技术人民军医出版社,2002年月

lO月

2.丁静娟,张伟三,等.乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检

测方法研究.中华实验和临床病毒学杂志,2004年3月

（收稿日期2OO5—06—19）（编辑寒梅）

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?

药物与临床?

口服降糖药的临床应用

苏德禹

【中图分类号】R969.4【文献标识码】B【文章编号】1680—98~（mos）一09—0820—01

糖尿病（DM）是严重危害人类健康的常见病,对人类的健康感性.由于只降低高血糖,因而不会引起低血糖反应.此类药

构成了严重威胁.寻求更有效的药物控制糖尿病的发展,减少物主要有苯乙双胍,二甲双胍,吡咯苯胍.苯乙双胍易引起乳酸

糖尿病的危害,是目前治疗糖尿病的主要方向.口服抗糖尿病性酸血症渐趋淘汰.吡咯苯胍能刺激胰岛素8细胞分泌,抗血

药物具有方便,快捷,无痛苦,可持续长期使用等优点,在临床被小板黏附,抑制脂肪分解,增加葡萄糖的利用,作用比苯乙双胍

广泛应用.强,不引起乳酸性酸血症.二甲双胍能明显改善糖尿病患者的

1磺酰腺类（SU）糖耐量和高胰岛素血症,对餐后餐前均有明显降低作用.

该类药物可特异性阻滞胰岛J3细胞上ATP敏感性钾通道,5嚏唑烷二酮类

导致膜去极化,促使电压依赖Ca2通道开放,引起胞浆内Ca2噻唑烷二酮类药物是近年来新开发的一种很有前途的胰岛

浓度升高,从而增加胰岛素分泌和释放.磺酰脲类适用于食素增敏剂,目前已经开发的同类药物有曲格列酮,噻格列酮等多

疗,运动,减重仍不能控制的非肥胖的2型糖尿病患者,第一代种.以曲格列酮研究最有深入,也最早在临床应用.噻唑烷二

有甲基磺丁脲D860,第二代格列本脲,格列喹酮,格列齐特,梅酮类机理尚未阐明,有人认为与其能抑制脂肪源性肿瘤坏死因

列波脲.格列喹酮其作用强,剂量小,不良反应相对较小已广泛子一a（TNF—a）产生有关,因为脂肪源TNF—a可降低骨骼肌细

应用于临床,主要从胆汁排泄,可改善肾脏血流,较少引起肾功胞的胰岛素受体的酪氨酸激酶活性,抑制胰岛素受体底物一I

能障碍,适用于肾功能轻中度不良的2型糖尿患者,第三代的的磷酸化并抑制葡萄糖转运因子一4的表达,从而引起胰岛素

格列美脲除具有第一代的作用机制外,还能增加组织对胰岛素的抵抗,而噻唑烷二酮可明显抑制脂肪组织产生TNF—a,并可

的敏感性而发挥降血糖作用.促进GLU一4在骨骼肌的表达,从而提高机体的胰岛素的敏感

2快速促胰岛素分泌型性0’.

此类药物为苯甲酸和苯丙氨酸衍生物,主要药物有美格列

定及其衍生物,瑞格列萘,美格列萘,瑞格列定,那格列定,吗啉

胍化合物等.瑞格列萘是苯甲酸衍生物,是促胰岛素分泌剂,其

作用机制是通过与胰岛8细胞膜上的特异性受体结合来促进胰

岛细胞上ATP的敏感性K通道关闭,抑制K从8细胞外流,使

细胞膜去极化,从而开放电压依赖的Cd通道,使细胞外Ca2

进入胞内,促进储存的胰岛素分泌,瑞格列萘对功能受损的胰

岛细胞起到保护作用,它最大的优点是可以模仿胰岛素的生理

性分泌,该药主要适用于2型糖尿病患者.

3伍一葡萄糖药醴抑制剂

这类药物能抑制小肠上皮刷状缘的a葡萄糖苷酶,使肠内

葡萄糖的产生吸收减慢,降低餐后血糖,适用餐后高血糖,并能

改善外周靶组织对胰岛素的敏感性,减少糖尿病患者的胰岛素

的用量.目前常用阿卡波糖,优格列波糖,两者降糖作用相当,

作用位点稍有差异,优格列波糖肠胀气等反应较小.

4双胍类

主要用于肥胖的2型糖尿病,常与磺脲类或胰岛素合用,主

要通过增强外周组织糖的无氧酵解,增加组织细胞对糖的利用,

抑制肝糖原异生及肝糖生成,抑制或延迟肠壁细胞对葡萄糖的

摄取而降低餐后高血糖.本类药物还能改善组织对胰岛素的敏

作者单位:

365000福建省三明市第一医院药剂科

随着糖尿病基础理论研究的深入及临床药理学的迅速发

展,口服降糖药物的研究与开发取得了很大的发展,为糖尿病的

防治拓展了更加广阔的空间,各类降糖药特点各异,应采取个体

化给药,以更好地控制血糖,减少并发症的发生.

参考文献

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328～330

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社.1998:

459～465

7.李晨钟,张素华,舒昌达.胰岛素增敏剂研究新进展[Jj.国外医学

内分泌分册,l999;19

（1）:

29～30

（收稿日期2005—07—12）（编辑尹卫群）