05版药典微生物限度检查法操作要点.docx

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05版药典微生物限度检查法操作要点

05版药典微生物限度检查法操作要点

林丽英

05版药典微生物限度检查法与以往药典的最大不同就是多了方法验证。

由于以前版本的药典没有要求对检验方法进展必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不好难操作。

为了更好执行05版药典，现根据我的理解，对药典上的各种检验方法在验证时的操作要点与大家作个探讨。

一、验证的目的

由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果，将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。

对所建立的微生物限度检查法进展验证的目的，就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。

细菌计数验证所用的菌株：

大肠埃希菌[CMCC〔B〕44102]：

代表革兰阴性菌；

金黄色葡萄球菌[CMCC〔B〕26003]：

代表革兰阳性球菌；

枯草芽孢杆菌[CMCC〔B〕63501]：

代表革兰阳性杆菌；

霉菌计数验证所用的菌株：

白色念珠菌[CMCC〔F〕98001]：

代表酵母菌；

黑曲霉[CMCC〔F〕98003：

代表霉菌；

由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均达到要求，才说明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否那么，所得的结果是不能真实地反映样品的污染情况的。

菌液的制备：

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～l00cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，参加3~5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，吸出胞子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。

二、方法的验证

所有验证方法的操作均应在阳性接种间。

〔一〕、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证

验证方法取试验可能用的最低稀释级供试液进展验证。

验证试验至少应进展3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。

1．常规法

就是取1:

10的供试液1ml和50~100个试验菌株参加到1个平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，培养，计算各菌株的回收率。

常规法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？

试验组：

5×2=10个，即每个菌株做2ml共需10个；

菌液组：

5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。

共24个

本底菌组：

2个细菌计数，2个霉菌和酵母菌计数。

细菌计数验证所用的平皿共14个，其中6个用于试验组计数，6个用于菌液组计数，2个用于细菌本底菌计数，倾倒营养琼脂培养基；霉菌和酵母菌计数所用的平皿共10个，其中4个用于试验组计数，4个用于菌液组计数，2个用于霉菌本底菌计数，倾注玫瑰红钠琼脂培养基〔虎红琼脂培养基〕。

回收率=[（试验组菌数-本底菌组菌数）/菌液组菌数]

当大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌3个菌株的回收率均达到70%以上时，细菌计数用该验证的方法检验。

当白色念珠菌和黑曲霉2个菌株的回收率均达到70%以上时，霉菌计数用该验证的方法检验。

2．培养基稀释法

取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。

测定细菌、霉菌与酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每lml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为lml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规那么报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

具体操作：

〔以1ml分至5个皿为例〕

就是取1:

10的供试液1ml均匀分注到5个平皿中，每个皿0.2ml，每株试验菌平行制备2ml的平皿数，然后参加相应的琼脂培养基，培养，计算各菌株的回收率。

用该法做一个样品的细菌、霉菌和酵母菌计数验证试验，需要多少个平皿呢？

试验组：

5×10=50个，即每个菌株做2ml共需50个；

菌液组：

5×2=10个，即每个菌株的加菌量，每株2个皿。

共80个

本底菌组：

10个细菌计数，10个霉菌和酵母菌计数。

3．离心沉淀集菌法

取一定量的供试液，3000转/别离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/别离心5分钟，取全部上清液再离心）,弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

然后用此稀释液进展检验。

4．薄膜过滤法

取相当于每X滤膜含1g或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。

假设供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过滤。

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。

冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或真菌琼脂培养上。

每种菌株至少制备一X滤膜。

即每个验证样品至少制备7个膜。

〔5个试验组和2个本底菌〕

〔二〕控制菌检查方法的验证

验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定与以下要求进展。

菌种对试验菌种的要求同细菌、霉菌与酵母菌计数方法的验证。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（CMCC（B）26003）

乙型付伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）（CMCC（B）50094）

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaerugmosa）（CMCC（B）10104）

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）（CMCC（B）64941）

菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。

用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为10~l00cfu的菌悬液。

验证方法

〔1〕试验组取规定量供试液与10~100cfu试验菌参加增菌培养基中，依相应控制菌检查法进展检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

〔2〕阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。

方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。

阴性对照菌不得检出。

结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。

假设试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进展供试品的该控制菌检查；假设试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进展方法验证。

三、检验方法

〔一〕计数法的检验

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。

检查时，按已验证的计数方法进展供试品的细菌、霉菌与酵母菌菌数的测定。

1．平皿法

常规法和培养基稀释法都是平皿法。

供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法检查。

采用平皿法进展菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。

取供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中〔培养基稀释法，那么将1ml供试液均匀分注入2个或以上的平皿中〕，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验取试验用的稀释液lml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进展菌落汁数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规那么报告菌数。

假设同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，那么两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌与酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

在特殊情况下，假设营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，那么应分别点汁霉菌和酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进展比拟，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

菌数报告规那么宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。

假设比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；假设比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进展方法的重新验证。

（3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

2．薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。

选择滤膜材质时应保证供试品与其溶剂不影响微生物的充分被截留。

滤器与滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分枯燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液与冲洗液覆盖整个滤膜外表。

供试液经薄膜过滤后，假设需要用冲洗液冲洗滤膜，每X滤膜每次冲洗量为100ml。

每片滤膜的总过滤量不宜过大，以防止滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每X滤膜含1g或lml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。

假设供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过滤。

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证〞。

冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一X滤膜。

阴性对照试验取试验用的稀释液lml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。

培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。

菌数报告规那么以相当于1g或lml供试品的菌落数报告菌数；假设滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每X滤膜过滤1g或1ml供试品），或<1乘以最低稀释倍数的值报告

〔二〕控制菌检查法

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进展，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。

阳性对照试验供试品进展控制菌检查时，应做阳性对照试验。

阳性对照试验的加菌量为l0～l00cfu，方法同供试品的控制菌检查。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验取稀释液10m1照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

控制菌检查采用培养基稀释法时，可加大增菌培养基的用量。

根本程序：

供试液制备增菌培养选择性培养基培养挑取疑似菌落生化试验报告结果

1.大肠菌群的检查

取含适量（不少于10m1）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别参加1：

10的供试液lml（含供试品0.1g或0．1m1）、1：

100的供试液lml（含供试品0．01g或0．0lml）、1：

1000的供试液lml（含供试品0．001g或0．001m1），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管参加稀释液lml作为阴性对照管。

培养18～24小时。

胆盐乳糖发酵管假设无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；假设产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

假设平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；假设平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进展确证试验。

表2大肠菌群菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫黑色、浅紫色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，外表光滑，湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，外表光滑，湿润

确证试验从上述别离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。

假设产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否那么判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或lml供试品中的大肠菌群数。

表3可能的大肠菌群数表

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N（个/g或ml）

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

+

+

+

-

+

+

-

-

+

-

-

-

>103

102

10

<10

注：

+代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。

2.梭菌检查

取供试液10ml（相当于供试品1g、lml）2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。

上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的新鲜庖肉培养基中。

各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。

如试验管不出现浑浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否那么，应取上述培养物0.2m1，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48～72小时。

假设平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；假设平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进展革兰染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3％过氧化氢试液，假设菌落外表有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否那么为阴性。

假设上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否那么判供试品未检出梭菌。

结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。

眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。

假设供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数与控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；假设其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。