微生物限度检查SOP.docx

微生物限度检查SOP.docx

《微生物限度检查SOP.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物限度检查SOP.docx（28页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

微生物限度检查SOP

微生物限度检查SOP

1.适用范围：

适用于本公司各品种微生物限度检查。

1.职责

检验员：

严格按SOP进行检验。

QC主管：

监督检查执行情况。

2.定义

微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及原、辅料、包材受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。

3.微生物限度检查的一般要求

4.1环境要求微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

4.2.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。

4.3培养温度要求除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。

4.4检验结果报告单位检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，包材按相应质量标准的规定进行。

4.5抽样和样品保存

4.5.1.按批号随机抽样，抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

4.5.2.抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。

4.5.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品可直接判为不合格品，无须再抽样检验。

4.5.4.供试品在检验之前，保存于阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻。

4.5.5.供试品在检验之前，保持原包装状态，严禁开启，并保存在阴凉干燥处（勿冷藏或冷冻）。

已开启样品不得作为供试品。

4.6.主要仪器及器具

恒温培养箱、生化培养箱、恒温水浴锅、电冰箱、超净工作台、生物显微镜、放大镜、电热恒温干燥箱、电热压力消毒器、药物天平、锥形瓶、研钵、培养皿（9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）、吸管（1ml）、棉塞、接种针、记号笔。

5.检验量

5.1检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2））

5.2所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位。

固体及粘稠性供试品的检验量为10g，液体制剂检验量为10ml；中药膜剂为50cm2；贵细药品、微量包装药品的检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。

包材检验量按相应质量标准的规定进行。

6.操作方法

6.1.试验前准备

6.1.1.将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。

准备好足够用量，避免操作中出入操作间。

6.1.2.开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。

6.1.3.操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。

6.1.4.操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。

6.1.5.供试品制成供试液后，在1小时内注皿操作完毕。

6.2.供试液的制备

6.2.1.根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。

6.2.1.1.液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：

10的供试液。

油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

6.2.1.2.固体、半固体或粘稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：

10的供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

6.2.1.3.需用特殊供试液制备方法的供试品

6.2.1.4.非水溶性供试品

方法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸镁甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：

20的供试液。

方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XIIIB无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。

然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：

10的供试液。

6.2.1.5.膜剂供试品

取供试品50cm2,剪碎，加50ml或100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：

10或1：

20的供试液。

6.2.1.6.肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：

10的供试液。

6.2.1.7.气雾剂、喷物剂供试品

取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，防至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。

用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：

10的供试液。

6.2.1.8.具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌后，在依法检查，常用的方法如下。

●培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。

测定细菌、霉菌及酵母的菌数时，取同稀释级的供试液2ml每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃取上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

●薄膜过滤法见细菌、酶菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”

●中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭和剂消除其抑菌成分。

中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

7.细菌、霉菌及酵母菌检查

7.1计数方法和计数方法的验证

7.1.1当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对各试验菌的回收率应逐一的进行验证。

7.1.2.菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]

白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]

黑曲酶（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]

7.1.3.菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁培养琼脂斜面培养基中，培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的菌悬液。

接种黑曲酶的新鲜培养物至改良马丁培养琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

7.1.4..验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

7.1.4.1.试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

薄膜过率法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

7.1.4.2.菌液组测定所加的试验菌数。

7.1.4.3.供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

7.1.4.4.稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等待处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液替代供试验品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

7.1.5.结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

7.1.6.验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

7.2.检查法

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。

检查时，按验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。

取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：

10、1：

102、1：

103等稀释级。

7.2.1.平皿法

7.2.1.1采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释剂的供试液。

7.2.1.2.取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

7.2.1.3.阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养，每种用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

7.2.1.4.培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计技能落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，有般以72小时的菌落数报告；必要时可适当延长培养时间5～7天进行菌落计数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不适宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍以上。

7.2.1.5.一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂基于霉菌及酵母菌计数。

在特殊情况下，若营养琼脂基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

7.2.1.6.含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

7.2.1.7.菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、，霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级。

作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘一稀释倍数的值报告菌数。

7.2.1.8.当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。

若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2而不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再进行检查，必要时，应进行方法的重新验证。

7.2.1.9.当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

7.2.1.10.如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数少于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌落数。

7.2.2.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径约为50nm。

选择滤膜材质时应保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留。

滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试品过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。

油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。

每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

7.2.2.2.取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试溶液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。

若供试品每1g或1ml所含的菌数比较多时，可取适量稀释级的供试液1ml，过滤。

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。

冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉

葡萄糖琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一张滤膜。

7.2.2.3.阴性对照品试验取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。

7.2.2.4.培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。

7.2.2.5.菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

控制菌检查

8.控制菌检查方法和检查方法的验证

8.1当建立药品的微生物限度检查法时间，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

8.1.1验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌检查法的规定及下列要求进行。

8.1.2.菌种对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

大肠埃希菌（Esherichiacoli）[CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）[CMCC（B）26003

乙型付伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC（B）50094]

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]

8.1.3.菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。

8.1.4.验证方法

8.1.4.1.试验组取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

8.1.4.2.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。

方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单细胞、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。

阴性对照菌不得检出。

8.1.4.3.结果判断

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。

若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试菌，应采用培养基稀释法（供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：

100放大为1：

300、1：

500或1：

1000，由于盛放培养基容器体积有限，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不强的供试品）、离心沉淀集菌法（取规定量的供试液，如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心10-30min，取下面1ml液体，并将适量的稀释剂洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养。

适用于中度抑菌的供试品）、薄膜过滤法（取规定量的供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中）、中和法（常用的中和剂有：

磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸；含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸；洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%）；卤素中加入硫代硫酸钠（0.1%）。

）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

8.1.4.5.验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行

8.2.检查法

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。

8.2.1.阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照实验。

阳性对照试验的加菌量为10～100cfu,方法同供试品的控制菌检查。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

8.2.2.阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

8.2.3.大肠埃希菌（Escherichiacoli）检查取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml,接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

若管内培养物呈现荧光，，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性，靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。

若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。

表1大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润

8.2.4.大肠菌群（Coliform）检查取含适量（不少于10-ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：

10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml），1：

100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml），1：

1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管，培养18～24小时。

胆酸乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生产的菌落与表2所列的菌落形态特征相符合或疑

似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。

表2大肠菌群菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边

缘整齐，表面光滑，湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润

确证试验从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种与乳糖发酵管中，培养24～48小时，若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表3可能的大肠菌群数表

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N（个/g或ml）

0.1g或0.1ml

0.01g或0.001ml

0.001g或0.001ml

+

+

+

＞103

+

+

－

102＜N＜103

+

－

－

10＜N＜102

－

－

－

＜10

注：

+代表检出菌群；－代表未检出大肠菌群

8.2.4.沙门菌（Salmonella）检查取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。

取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺钠亮绿培养基中，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。

若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落数与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌，否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验或血清凝集试验，确认是否为沙门菌。

表4沙门菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

胆酸硫乳琼脂

无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

沙门、志贺菌属琼脂

无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色

曙红亚甲蓝琼脂

无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落

麦康凯琼脂

无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色

8.2.5.铜绿假单细胞（Pseudomonasaeruginosa）检查取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）,直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。

取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

铜绿假