脂肪酶产生菌发酵条件的优化.docx
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脂肪酶产生菌发酵条件的优化
绵阳师范学院
本科生毕业论文（设计）
题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化
专业生物技术
院部生命科学与技术学院
学号0811420218
姓名杜长蔓
指导教师李俊刚
答辩时间2012年5月
论文工作时间：
2011年7月至2012年5月
脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化
学生：
杜长蔓
指导老师：
李俊刚
摘要：
本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：
1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉+1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：
初始pH7.5，接种量1.5%，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60U/ml,较优化前提高了49.57%。
脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。
对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。
关键词：
脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；
LipasetoproducebacteriaM-6-2Optimizationoffermentationconditions
Undergraduate:
DuChangman
Supervisor:
LiJunGang
Abstract:
Inthispaper,LaboratoryscreeningandidentificationoflipaseproductionbybacteriaintheM-6-2growthkineticsandenzymeproductionkineticswerestudied;throughsinglefactorexperimentsandorthogonaltest,thelipasetoproducebacteriaM-6-2shakerfermentationlipasemediumcompositionandcultureconditionswereoptimizedtocometoabetterenzymeproductionmediumcompositionformula:
1.5%starchand0.5%yeastextractascarbonsource,4.5%ofthesoybeanpowderand1.5%ammoniumnitrateforthebestsourceofnitrogen,0.05%disodiumhydrogenphosphateand0.15%magnesiumsulfate.Optimalfermentationconditionswere:
initialpH7.5,1.5%oftheinoculumsize,liquidvolume20ml/250ml,fermentationtemperature35°C,inthespeed180r/minnext,cultured16hAfteroptimizationofthefermentationbrothlipaseactivitycanreach49.57%to15.60U/ml,comparedtobeforeoptimization.LipasetoproducebacteriaM-6-2andreportedinChinaintheproductionoflipasebacteriacomparedtothehighactivityofenzymeproduction.Ofthestrainfermentationconditionsoptimized,laidthefoundationfortheproductionoftest.
Keywords:
LipaseproducingstrainM-6-2；lipase；fermentationconditions；optimization；orthogonaltest
目录
1前言1
1.1脂肪酶的概况1
1.2国内外脂肪酶的研究概况2
1.3本研究的目的及意义2
2实验材料和器具3
2.1实验菌种3
2.2主要实验仪器3
2.3实验试剂3
2.4培养基4
3实验流程4
4.实验方法4
4.1生长曲线的测定4
4.2产酶曲线的测定5
4.3脂肪酶产生菌m-6-2菌体生长的最佳条件的确定5
4.3.1pH对m-6-2菌体生长的影响5
4.3.2温度对m-6-2菌体生长的影响5
4.3.3装液量对m-6-2菌体生长的影响6
4.3.4摇床转速对m-6-2菌体生长的影响6
4.4脂肪酶培养基的优化7
4.4.1脂肪酶培养基单因素条件的优化7
4.4.2产脂肪酶培养基的正交试验7
4.5脂肪酶发酵条件优化8
4.5.1发酵条件单因素条件优化8
4.5.2产脂肪酶发酵条件的正交试验9
5分析方法9
5.1脂肪酶酶活测定与计算方法9
5.2酶活测定的原理9
5.3酶活的定义9
5.4酶活的测定9
5.5酶活的计算方法：
9
5.6生物量的测定10
6结果与讨论10
6.1生长曲线的测定结果10
6.2产酶曲线的测定结果11
6.3菌体的生长和产酶动力学关系11
6.4脂肪酶产生菌m-6-2菌体生长最佳条件的确定结果11
6.4.1pH对m-6-2菌体生长的影响11
6.4.2温度对m-6-2菌体生长的影响12
6.4.3装液量对m-6-2菌体生长的影响13
6.4.4摇床转速对m-6-2菌体生长的影响13
6.5脂肪酶培养基的优化14
6.5.1单因素实验14
6.5.2正交试验17
6.6脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化18
6.6.1单因素实验18
6.5.2正交实验21
6.6讨论22
参考文献24
致谢26
1前言
1.1脂肪酶的概况
脂肪酶酶[EC3.1.1.3]又称三酰基甘油酰基水解酶（acylglycerolhydrolases）[1]，是一类具有多种催化能力的酶，广泛存在于动植物、植物及微生物中。
脂肪酶具有多种催化能力，能够催化酯类的醇解，水解，转酯，酯化化及酯类的逆向合成反应[2][3][4][5][6]。
除此之外，还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、胆固醇酯酶、溶血磷脂酶、酰肽水解酶活性等。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换，它具有化学选择性和立体异构专一性，反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少，因此被广泛的应用于轻纺、食品、皮革、化妆品、香料、医药、有机合成、洗涤剂、污水处理等[7]。
微生物脂肪酶种类多、易发生遗传与变异，繁殖快，pH值范围及作用温度比动植物脂肪酶广，而且底物专一性高，而且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工业生产以获得较高纯度的酶制剂，已成为工业生产脂肪酶的主要来源，并在理论援救方面也具有重要的意义。
脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为单酯油酯、甘油二酯、脂肪酸和甘油。
作为一种高效无污染的脱脂剂，脂肪酶在皮革脱脂工艺上尤其具有重要的用途，它可以把不易皂化，难溶于水的脂肪分解为易溶于水的脂肪酸和甘油，且在碱性条件下使得脂肪更容易从皮中除去。
与传统的乳化法、皂化法和溶剂法脱脂相比较，酶法脱脂皮板柔软，对皮革质量有明显的提高。
脂肪酶还可以作为临床诊断胰腺炎、脂血病等疾病的依据之一，市场上也已经有作血脂分析用的酶制剂出售。
屠宰场、餐饮业、奶制品加工厂等产生的废水中富含易生物降解的有机物和难生物降解的油脂。
普通餐饮废水中油脂含量为100～831mg/L[8]，如果不经处理直接排放，会造成环境的严重污染。
油脂漂浮在水面形成油膜，阻碍氧气传输，从而威胁水生动植物的生存[9]。
目前的油脂废水处理工艺有生态处理和生物处理。
生物处理技术包括厌氧、好氧以及二者组合工艺。
采用生物反应器处理油脂废水时，油脂包裹在污泥表面，阻碍了传质作用，降低了底物转化速率[10]；此外，反应器中丝状菌大量繁殖，油脂附着在污泥表面，造成污泥沉降困难，易导致活性污泥的大量流失。
在上述情况下，反应器会出现恶臭气味溢散和堵塞等运行问题。
采用人工湿地等生态法处理油脂废水也很容易出现堵塞现象[11]。
目前，成熟的油脂降解技术尚未出现，而国家规定的污水排放标准日益严格，油脂废水处理技术的改进非常需要。
对于饮食习惯中，油占重要部分的国家，油脂废水处理难题尤为突出。
由于微生物资源丰富，生产不受自然环境的影响，可用人工控制来大量生产目的酶，生产成本低，产酶周期短，是一种经济而实用的方法。
脂肪酶在微生物界分布很广，土壤是微生物的大本营，不同土壤中的微生物所产生脂肪酶性能不尽相同。
其产生菌主要是细菌和霉菌[12]。
已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中7种是细菌，18种是霉菌。
目前报道的用于产生脂肪酶的微生物主要有无根根霉（Rhizopusarrhizus）[13]、扩展青霉（Penicilliumexpansum）[14]、假丝酵母（Candidarugosa）[15]、假单孢菌（Pseudomonassp.）[16]等,其中从根霉菌中已分离到30多种脂肪酶,且有多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂[17]。
1.2国内外脂肪酶的研究概况
脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的合成和水解反应，这些反应通常具有对映选择性，区域性或，高底物专一性，使脂肪酶成为有机合成中重要的生物催化剂。
近年来，微生物脂肪酶在各种不同行业得到了广泛的应用，主要是利用脂肪酶的水解反应，水解反应是指脂肪酶催化脂肪或脂水解为其组成脂肪酸和甘油或醇，以此应用脂肪酶的方面及行业包括：
污水处理、脂肪酸提纯、脂肪水解、甘油酯结构的测定、生产纸浆和造纸、皮革、加酶洗涤剂、医学应用、食品成分、底纸脱墨等；其次，应用脂肪酶合成作用的包括低中相对分子质量聚脂、脂、手性化合物的合成、药物、油脂改性和化妆品等。
2003年，中国极地研究中心的俞勇[18]等，从南极乔治王岛冻土来源的76株低温细菌中，筛选到13株低温脂肪酶产生菌,并对其中的BTs10022菌株进行了鉴定和酶学性质的初步研究；2004年邵铁娟[19]等对渤海海泥中筛选到的一株产低温脂肪酶微生物进行了菌种鉴定及产脂肪酶发酵条件的研究；2006年,张金伟[20]等从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶菌株7195,并对其进行了鉴定和初步分离纯化；其中南极假丝酵母脂肪酶B的污水处理方面用途最为广泛，该酶从南极假丝酵母（Candidaantarctica）中分离得到，对非水溶性和水溶性物质都有极强的催化活性[21]；Cihangir和Sarikaya[22]从土耳其土样中分离了一株曲霉菌，在pH5.5、温度30℃下培养96h获得了酶活为17U/ml的脂肪酶；Azeredo等[23]针对青霉菌展开液态发酵和固态发酵研究，在pH5.5、温度30℃下液态发酵96h获得了酶活为12U/ml的脂肪酶，而在湿度70%、温度30℃下固态发酵24h获得了酶活为17U/g的脂肪酶。
尽管目前已经对脂肪酶产生菌展开了一些研究,但有关产脂肪酶细菌的报道还不多,作者从自然界中分离和筛选得到一株产脂肪酶细菌M-6-2,显示其可以分泌脂肪酶的高产菌株,故对其产酶发酵条件进行了优化。
使其产酶活力更高，为生产性试验奠定基础。
1.3本研究的目的及意义
随着对脂肪酶研究的日益深入，其应用领域正日渐拓宽，与此相应，新型脂肪酶的研究开发就备受关注[24]。
通过对原有脂肪酶改进或对菌株进行优化培养可得到新型的脂肪酶[25]。
本研究的具体目标是对产脂肪酶的细菌M-6-2发酵条件的优化，为中试、生产性试验提供参考数据，从而提高其产脂肪酶酶活力，使其产酶达到国内先进水平。
该菌种如果应用于生产，将对屠宰厂、肉联厂、大型食堂等含油脂的污水厂废水处理带来巨大的社会效益和环境生态效益。
2实验材料和器具
2.1实验菌种
本实验采用从绵阳六里村屠宰场废水沟的污泥中筛选和鉴定出的的脂肪酶高产菌株M-6-2。
2.2主要实验仪器
移液管（10ml）；
磁力搅拌器；
酸式滴定管（25ml）；
碱式滴定管（25ml）；
SPX-250B-Ⅱ生化培养箱（上海康华生化仪器制造厂出产）；
HZ-9311K恒温振荡器（金坛市新航仪器厂出产）；
SP-DJ系列超净工作台（吴江市净化设备总厂出产）；
手提式高压灭菌锅（上海三中医疗器械有限公司出产）；
申溢牌电热不绣钢蒸馏水器（上海三中医疗器械有限公司出产）；
冰箱（BCD-216E/BN海尔集团公司）；
电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9053A型上海精宏实验设备有限公司）；
高速冷冻离心机（贝克曼库尔特实验系统有限公司广州分公司）；
电子万用炉（220V.AC1000W，北京市永光明医疗仪器厂）；
FA1104A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；
SartoriusBP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；
HHS-Ⅱ-2数显恒温水浴锅（上海康华生化仪器制造有限公司）；
721型紫外可见分光光度计（Amershambiosciences）；
2.3实验试剂
a）0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液：
称取分析纯的氢氧化钠4.5g用蒸馏水溶解定容至1000ml（约0.1mol/L氢氧化钠），用邻苯二甲酸氢钾标定，然后再用蒸馏水稀释至0.05mol/L。
储存于附有钠石灰管的玻璃瓶中；
b）2%的聚乙烯醇溶液：
取20g聚乙烯醇加蒸馏水约1000mL，水浴加热至溶，冷却后定容至1000mL，配成2%的聚乙烯醇溶液，双层纱布过滤备用；
c）聚乙烯醇橄榄油乳化液：
将橄榄油与上述2%的聚乙烯醇溶液以1：
3的比例混合。
用高速组织捣碎机处理6min，分两次，每次3min，间隔5min，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液；
d）酚酞试剂：
称取酚酞0.1g，溶于250ml90%的乙醇中；
e）丙酮—乙醇混合液：
将丙酮和乙醇按1:
1混合；
f）磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.5）：
0.2mol/L磷酸氢二钠84ml，0.2mol/L磷酸二氢钠16ml，加蒸馏水稀释至200ml。
2.4培养基[26]
斜面培养基：
0.2%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4，3%蔗糖，1.5%-2.0%琼脂。
种子培养基：
0.5%葡萄糖，2%黄豆饼粉，0.5%酵母膏，1%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4。
初始设计发酵培养基：
4%黄豆饼粉，1%橄榄油，1%NaCl，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05%MgSO4，0.001%FeSO4。
生长曲线的测定
3实验流程
产酶曲线的测定
菌体生长条件的确定
实验流程
脂肪酶培养基的优化
脂肪酶发酵条件的优化
4.实验方法
4.1生长曲线的测定[27]
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接13瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，即30℃,180r/min；
（5）每隔4h拿出一瓶（包括0h），以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度值，填入下列表1-1；
（6）以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，作生长曲线。
表1-1生长曲线的测定
Table1-1Determinationofgrowthcurve
培养时间/h
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
OD值
4.2产酶曲线的测定
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接13瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，即30℃,180r/min；
（5）每隔4h取出一瓶（包括0h），进行酶活力的测定，并填入下列表1-2；
（6）以培养时间为横坐标，以酶活力为纵坐标，绘制出产酶曲线。
表1-2产酶曲线的测定
able1-2forenzymeproductioncurvedetermination
培养时间/h
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
酶活/U
4.3脂肪酶产生菌m-6-2菌体生长的最佳条件的确定
4.3.1pH对m-6-2菌体生长的影响
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接11瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，其中pH值，分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0（根据初筛和复筛确定），即30℃,180r/min；
（5）放在相同的条件下培养24h后，以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度值，填入下列表1-3；
（6）以培养的pH值为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线。
表1-3生长最佳pH
Table1-3growthoptimumpH
培养pH值
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
OD值
4.3.2温度对m-6-2菌体生长的影响
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接11瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，其中温度分别为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃（根据初筛和复筛确定），180r/min；
（5）放在相同的条件下培养24h后，以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度值，填入下列表1-4；
（6）以培养温度为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线。
表1-4生长最佳温度
Table1-4optimumgrowthtemperature
培养温度℃
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
OD值
4.3.3装液量对m-6-2菌体生长的影响
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接11瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，其中装液量，分别为每250ml三角瓶中为10ml、12ml、14ml、16ml、18ml、20ml、22ml、24ml、26ml、28ml、30ml（根据初筛和复筛确定），30℃，180r/min；
（5）放在相同的条件下培养24h后，以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度值，填入下列表1-5；
（6）以培养的pH值为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线
表1-5装液量的影响
Table1-5installedtheinfluenceofthefluidvolume
装液量/ml
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
OD值
4.3.4摇床转速对m-6-2菌体生长的影响
（1）制配种子培养基和初始发酵培养基，0.1MPa灭菌30min，备用；
（2）将受试菌种在斜面培养基上活化，培养成熟；
（3）从成熟斜面上挑取5环菌苔或孢子接入7ml无菌水中，摇匀，吸取0.5ml菌悬液接发酵培养基中，一共接7瓶；
（4）将三角瓶放入摇床上，在复筛确定的适合的条件下培养，其中摇床转速，分别为160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min（根据初筛和复筛确定），30℃；
（5）放在相同的条件下培养24h后，以不接种的培养基作对照，在560nm处测吸光度值，填入下列表1-6；
（6）以培养的pH值为横坐标，吸光度值为纵坐标，作曲线。
表1-6摇床转速对m-6-2菌体生长的影响
Table1-6oftherotationspeedoftheM-6-2cellgrowth
摇床转速r/min
160
170
180
190
200
210
220
OD值
4.4脂肪酶培养基的优化[28]
4.4.1脂肪酶培养基单因素条件的优化
4.4.1.1最佳碳源的优化
以初始设计发酵培养基为基础，分别将橄榄油替换为葡萄糖、淀粉、酵母膏、麦芽糖、蔗糖、乳糖；接种体积分数均为1%，30℃，180r/min条件下摇瓶培养16h后，用滴定法测酶活，以确定碳源对发酵产酶的影响。
4.4.1.2复合碳源的优化
以初始设计发酵培养基为基础，分别将橄榄油替换为淀粉和酵母膏（最佳碳源优化的结果），按不同成分比例混合后，以1%的含量分别作为培养基中的碳
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