SN出口食品中大肠菌群大肠杆菌检测方法.docx

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SN出口食品中大肠菌群大肠杆菌检测方法

中华人民共和国进出口商品检验行业标准

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群SN0169—92

和大肠杆菌检验方法代替ZBX09002一88

Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliform

andescherichiacoliinfoodforexport

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1主题内容与适用范围

本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。

本标准适用于出口食品的检验。

2设备和材料

2.1吸管:

1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。

2.2水浴箱:

44.5±0.5℃。

2.3培养箱:

36±1℃,44.5±0.5℃。

2.4冰箱:

0~5℃和-15~-20℃。

2.5均质器。

2.6乳钵和研棒。

2.7平皿:

直径90mm。

2.8天平:

感量0.1g。

2.9显微镜。

2.10稀释瓶:

100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。

2.11玻璃珠:

直径约5mm。

2.12菌落计数器。

3培养基及试剂

3.1月桂基硫酸盐胰蛋白（月示（LST肉汤。

3.2煌绿乳糖胆盐（BGLB肉汤。

3.3EC肉汤。

3.4伊红美蓝琼脂（EMB。

3.5营养琼脂斜面。

3.6色氨酸肉汤。

3.7MR-VP培养基。

3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。

3.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA。

3.10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。

3.11生理盐水。

3.12革兰氏染色液。

3.13Kovacs氏靛基质试剂。

3.14甲基红指示剂。

3.15Voges-proskauer（V-P试剂。

4样品制备

4.1以无菌操作取有代表性的样品。

如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。

若不能

及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。

检

验前冷冻样品可于2~5℃18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。

4.2不同食品样品匀液的制备

4.2.1液体食品

以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠,以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇,制成1:

10的样品匀液。

4.2.2固体和半固体食品

以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:

10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替。

4.3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递

增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。

从制备样品匀液至稀释完毕,全过程

不得超过15min。

5大肠菌群的测定

5.1大肠菌群MPN值的测定

5.1.1对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。

每个稀释度接种三管月

桂基硫酸盐胰蛋白（月示（LST肉汤,每管接种1mL。

5.1.2将接种管置于36±1℃培养48±2h。

5.1.3观察试管的产气情况:

检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。

如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一

步作证实试验。

5.2大肠菌群的证实试验

5.2.1将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB肉汤管中。

5.2.2置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。

5.2.3记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4结果报告:

按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B（补充件]报告每克（毫升样品中大肠菌群的MPN值。

6粪大肠菌群测定

6.1用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。

水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。

应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3记录EC肉汤管的产气情况。

产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群

试验阴性。

6.4结果报告:

按产气管数,查MPN表报告每克（毫升样品中粪大肠菌群的MPN值。

7大肠杆菌测定

7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB平板,36±1℃培养24±2h。

7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平

板上至少挑取2个可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。

7.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

7.4.1色氨酸肉汤:

在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。

7.4.2MR-VP培养基:

在36±1℃培养48±2h。

以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试

管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。

如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤:

于36±1℃培养96h记录有无生长。

7.4.4LST肉汤:

于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。

7.4.5革兰氏染色:

取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。

大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:

━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基质┃MR┃VP┃枸椽酸盐┃鉴定（型别

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃-┃-┃典型大肠杆菌

-┃+┃-┃-┃非典型大肠杆菌

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃-┃+┃典型中间型

-┃+┃-┃+┃非典型中间型

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━-┃-┃+┃+┃典型产气肠杆菌

+┃-┃+┃+┃非典型产气肠杆菌

━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做

重复试验。

7.5结果报告:

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++

--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克（毫升样品中大肠杆菌MPN值。

8大肠菌群固体培养基测定法

8.1样品制备同第4章。

8.2计数

8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。

另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。

8.2.2将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA10~15mL倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。

8.2.3待琼脂凝固后,再加3~4mLVRBA覆盖平板表层。

8.2.4翻转平板,置于36±1℃培养18~24h。

8.2.5选用有30~150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。

典型菌落为

紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。

菌落直径为0.5mm或更大。

8.2.6证实

8.2.6.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内,36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。

8.2.6.2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。

对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏

染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。

8.2.7结果报告

经最后证实为阳性（产气,革兰氏阴性杆菌的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平

板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克（毫升样品中大肠菌群数。

例:

10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×10**4/g（mL=6.0×10**5/g（mL

附录A

培养基和试剂

（补充件

A1月桂基硫酸盐胰蛋白（月示（LST肉汤

胰蛋白（月示或胰酪胨（Trypticase20g

氯化钠5.0g

乳糖5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO42.75g

磷酸二氢钾（KH2PO42.75g

月桂基硫酸钠0.1g

蒸馏水1000.0mL

将各成分溶解于蒸馏水中。

分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH6.8±0.2。

A2煌绿乳糖胆盐（BGAB肉汤

蛋白胨10.0g

乳糖10.0g

牛胆粉（oxgall或oxbile溶液200.0mL

0.1%煌绿水溶液13.3mL

蒸馏水

将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,pH7.0~7.5,用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。

再加入0.1%煌绿水溶

液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管（管内有倒立

的小发酵管中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH7.2±0.1。

A3EC肉汤

胰蛋白（月示或胰酪（月示20.0g

3号胆盐或混合胆盐1.5g

乳糖5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO44.0g

磷酸二氢钾（KH2PO41.5g

氯化钠5.0g

蒸馏水1000.0mL

将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管,每管

8mL。

121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。

A4伊红美蓝琼脂（EMB

蛋白胨10.0g

乳糖10.0g

磷酸氢二钾（K2HPO42.0g

琼脂15.0g

伊红γ（水溶性0.4g或2%水溶液20mL

美蓝0.065g或0.5%水溶液13mL

蒸馏水1000.0mL

在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。

分装于三角烧瓶中。

每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。

最终pH7.1±0.2。

使用前将琼脂融化,于每

100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红γ水溶液和1.3mL0.5%的美蓝水溶液,摇匀,冷至45~50℃倾注平皿。

A5营养琼脂斜面

牛肉膏3.0g

蛋白胨5.0g

琼脂15.0g

蒸馏水1000.0mL

将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。

分装合适的试管。

121℃高压灭菌15min。

最终

pH7.3±0.1。

灭菌后摆成斜面备用。

A6色氨酸肉汤

胰胨或胰酪胨10.0g

蒸馏水1000.0mL

加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。

分装试管,每管5mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH6.9±0.2。

A7MR-VP培养基

（月示胨7.0g

葡萄糖5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO45.0g

蒸馏水1000.0mL

将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。

A8Koser氏枸椽酸盐肉汤

磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O1.5g

磷酸氢二钾（K2HPO41.0g

硫酸镁（MgSO4·7H2O0.2g

枸椽酸钠（含2H2O3.0g

蒸馏水1000.0mL

将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10mL,121℃高压灭菌15min。

最终pH6.7

±0.2。

A9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA

蛋白胨7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g

氯化钠5.0g

胆盐或3号胆盐1.5g

中性红0.03g

结晶紫0.002g

琼脂15~18g

蒸馏水1000.0mL

将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。

煮沸2min,将

培养基冷至45~50℃倾注平板。

临用时制备,不得超过3h。

A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液

贮存液

磷酸二氢钾（KH2PO434.0g

蒸馏水500mL

将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。

用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。

稀释液取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。

A11生理盐水氯化钠蒸馏水1000.0mL将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

A12革兰氏染色液结晶紫染色液：

结晶紫95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mL将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

革兰氏碘液：

碘碘化钾蒸馏水300.0mL将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。

沙黄复染液：

沙黄95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mL将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。

染色法a.将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。

b.d.滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。

滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。

c.滴加95％乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。

结果：

革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。

A13Kovacs氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛戊醇75.0mL盐酸（浓25.0mL将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。

A14甲基红指示剂甲基红0.1g95％乙醇300mL将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。

A15Voges-Proskauer（V-P试剂甲液α-萘酚无水乙醇100.0mL乙液氢氧化钾40.0g用蒸馏水加至100.0mL5.0g5.0g0.25g1.0g2.0g1.0g8.5g6

附检样中最近似值（MPN（MPN表补充件录B：

1g检样中最近似值（MPN表（补充件使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。

━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━阳性管数0.10.010.001000000000000000011111111111111110000111122223333000011112222333301230123012301230123012301230123┃MPN┃┃＜3┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃3693┃阳性管数┃┃9.1┃14┃20┃26┃15┃20┃27┃34┃21┃28┃35┃42┃29┃36┃44┃53┃23┃39┃64┃95┃43┃75┃120┃160┃93┃150┃210┃290┃240┃460┃1100┃＞1100┃━━━━━━━━━┫┣━━━━━━━━━━┫MPN｜0.10.010.001┃┃┃┃┃222222222222222233333333333333330000111122223333000011112222333301230123012301230123012301230123━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━6.1┃9.2┃12┃6.2┃9.3┃1216131619┃┃┃┃┃9.4┃━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━3.6┃7.2┃11151115191115202416202429┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃┃7.3┃━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━注:

①本表采用3个稀释度[0.1g（mL、0.01g（mL和0.001g（mL],每个稀释度接种3管。

②表内所列检样量如改用1g（mL、0.1g（mL和0.01g（mL时,表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL、0.001g（mL和0.0001g（mL时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。

━━━━━━━━━━━附加说明：

本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。

7

本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。

本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。

本标准主要参考美国公职分析化学家协会（AOAC法定分析方法第14版第46章（1984年。

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准1993-05-01实施8