ISO大肠菌群和粪大肠菌群测定.doc
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BSISO4832:
2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水平法--菌落计数技术
序
ISO是国际标准的全球性组织。
准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。
每一个团体成员负责各自的学科。
与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。
ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。
国际性标准的起草原则在《ISO/IEC细则》第三部分中有给出。
起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。
发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。
国际性标准ISO4831由ISO/IEC34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。
这个第三版的ISO4832取代了ISO4832:
1991和ISO5541-1:
1986。
主要的修改内容如下：
——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）；
——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。
考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO4832:
1991的选择性方法不受影响。
绪论
由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。
在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。
否则，要尽可能地完全遵循本标准。
当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。
同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。
希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。
本标准在技术上的描述没有ISO4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。
此外，由于另外两个标准中对“大肠菌群”的定义也不一致，因此检测出的微生物含量也不一定一致。
针对一些特殊的产品，方法的选择可参照相关的国际性标准。
基于一个可实行的方法的目的，在条况3中给出的“大肠菌群”的定义并作为操作程序的基础，并不需要与其它相关文献保持一致。
在其它文献中定义的“大肠菌群”，部分通过发酵管检测并不能产气。
因此本标准中的检测方法并不能用于所有其它文献中提及的“大肠菌群”。
1范围
本标准给出常规的方法检测及计数大肠菌群。
它可适用于：
——人类的食物及动物饲料；
——食品生产和食品处理领域的环境样品。
通过计数固体培养基培养后的菌落数，温度控制在30℃或37℃。
注意：
必须注意使用的温度，牛奶或奶制品的培养温度为30℃。
当估计每克或每毫升样品的数量超过100时，可使用本标准检测。
2参考文献
本标准的参考文献如下。
已过期的文献，后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。
未过期的文献，最新版本都是适用的。
ISO6887（所有部分），食物与动物饲料原料微生物学——样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释——第一部分：
样品原液和十倍法稀释的指导准则。
ISO7218，食物与动物饲料原料微生物学——微生物检验指导准则。
ISO8261，牛奶和奶制品——样品原液和十倍法稀释的指导准则。
ISO/TS11133-1，食物与动物饲料原料微生物学——准备和配制培养基的指导方针——第一部分：
实验室中培养基的配制及质控。
ISO/TS11133-2:
2003，食物与动物饲料原料微生物学——准备和配制培养基的指导方针——第二部分：
培养基配制的指导方针。
3术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
3.1大肠菌群
在特殊的温度下（例如30℃或37℃），按照本标准的操作，在结晶紫中性红胆汁乳糖培养基上的典型菌落，在确证实验中能发酵乳糖产气的一类细菌。
4原理
4.1准备两个固体选择性培养基，接种一定量的液体样品原液或其它类型样品的悬液。
在相同的条件下，接种其它稀释梯度，每梯度两个平板。
4.2平板置于30℃或37℃培养24h。
4.3计数平板上的典型菌落数，如必要，选取一定量的菌落做乳糖发酵实验。
4.4选择计数的平板上的典型菌落数可给出每克或每毫升样品的大肠菌群数量。
5培养基与稀释液
5.1概述
参照ISO7218，ISO/TS11133-1和ISO/TS11133-2中准备和配制培养基，及培养基性能测试部分。
5.2稀释液
参照ISO6887（相关部分），ISO8261或相关的国际性标准。
5.3固体选择性培养基：
结晶紫中性红胆汁乳糖（VRBL）培养基
5.3.1成分
动物组织消化酶
7g
酵母膏
3g
乳糖
10g
氯化钠
5g
胆汁盐
1.5g
中性红
0.03g
结晶紫
0.002g
琼脂
12g～18g
水
1000ml
5.3.2准备
以下操作程序是为了保存该选择性培养基并维持性状。
将所有成分或干粉培养基溶解至水中，静置数分钟。
调整pH值，使之在煮沸后为7.4±0.2，在25℃下。
加热至煮沸，并使它沸腾数次。
维持沸腾2min。
然后在水浴锅中冷却至44℃～47℃。
为了避免过分加热，不能加热过长时间或反复加热。
因此，不能放于灭菌锅中灭菌，并在使用前检查无菌状况。
在准备好后4h内使用。
5.3.3培养基质量控制
参考ISO/TS11133-1和ISO/TS11133-2:
2003，表B1。
5.4确证培养基：
亮绿乳糖胆汁肉汤
5.4.1成分
酪蛋白消化酶
10g
乳糖
10g
脱水牛胆汁
20g
亮绿
3.3g
水
1000ml
5.4.2准备
溶解所有成分或培养基干粉于水中，如需要可加热。
如需要，可在25℃调整pH值至7.2±0.2。
分装培养基至规格为16mm×160mm试管中，每管10ml。
121℃灭菌15min。
必须保证灭菌后试管中不产生气泡。
5.4.3培养基质量控制
参考ISO/TS11133-1和ISO/TS11133-2:
2003，表B1。
6仪器设备及玻璃器皿
一般的微生物实验室设备（参照ISO7218），特别的，增加以下几项。
6.1干热灭菌和湿热灭菌设备
6.2培养箱，可恒温35℃±1℃或37℃±1℃
6.3平皿，塑料或玻璃的，直径90mm～10mm
6.4移液器，1ml
6.5水浴锅，能恒温至44℃～47℃或100℃。
6.6菌落计数器
6.7试管，规格16mm×160mm
6.8发酵小导管
6.9三角瓶，用来煮沸和贮藏培养基
6.10pH计
6.11接种环，白金或铬化镍，直径大概3mm。
7取样
ISO6888中并不涉及取样。
如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。
微生物实验室接收到的样品必须是真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。
8样品前处理
参照ISO6887和ISO8261进行样品前处理。
如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。
9程序（见附录A）
9.1试验部分和样品原液
参照ISO6887和ISO8261和特殊产品的相关标准。
9.2接种和培养
9.2.1准备两个平皿，接种1ml样品原液或其它稀释梯度。
每个稀释梯度用一个移液器。
9.2.2每个平皿倾注15ml冷却至44℃～47℃的VRBL培养基。
从准备完样品原液至倾注平板的时间必须控制在15min内。
充分混匀接种物与培养基。
静置在水平面上凝固。
倾注15ml相同的培养基于空白平板中，做培养基无菌检查。
9.2.3待培养基凝固后，覆盖一层冷却至44℃～47℃的VRBL培养基于平板表面，大概4ml。
按照上述操作放置待凝固。
9.2.4倒置平板于培养箱中，30℃或37℃培养24h±2h。
9.3平板计数
培养结束后，选用10～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
详细的菌落计数操作见ISO7218。
非典型的菌落同样要做计数和确证，从奶制品中分离出来的菌落不仅含有乳糖，还有食糖。
培养后要立即按照9.4操作。
转化食糖会使菌落大小比典型菌落更小一些。
注意：
红色的胆盐沉淀环的产生由菌种的类型及培养基的质量决定。
9.4确证试验
每个非典型的菌落类型挑取5个菌落，接种亮绿乳糖胆汁肉汤，30℃或37℃培养24h±2h，观察产气情况。
按照证实实验的结果计算菌落数。
10结果报告
结果表述见ISO7218
11精密度
在微生物检测的泊松分布基础下，本标准的置信界限随着菌落计数结果的不同在16％～52％之间变化。
在实际操作中，更大的变化可能出现。
根据大量的研究，重复性的标准偏差（Sr）为0.2个log单位，再现性的标准偏差（SR）为0.35个log单位。
更详细的置信界限信息在ISO7218中已给出。
12测试报告
测试报告需包括以下：
——样品的信息；
——取样的程序，如果指导；
——使用的方法；
——使用的培养温度；
——本标准中没有涉及的具体操作，和任何可能对结果造成影响的细节；
——结果的获得，
——如有检查实验的重复性，给出结果。
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