大肠菌群检测.docx
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大肠菌群检测
曹双：
请综合看看各种方法，比较一下，有些内容是一致的，有些是每种方法不同于其他方法的，注意比较。
第一篇
（蓝色部分为说明和附录，去掉这部分剩下的为连续文件）
大肠杆菌检验方法
SN0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
GB/T4789.6—1994 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验（这两个检验方法另有完全的PDF文件，见文件夹）
以SN标准方法为例，进行说明。
样品制备：
以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:
10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
附：
这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法（最近似法）？
MPN法简介
发布日期：
2010-05-13 浏览次数：
212
TheMostProbableNumberMethod Inthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinocu
TheMostProbableNumberMethod
Inthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinoculatedfromeachoftheten-folddilutions,witheachtubebeinginoculatedwithoneml.
Afterincubation,thenumberoftubesshowinggrowthisrecorded.Asthesucceedingdilutionsweremade,theorganismsweredilutedtosuchanextentthatnonewereintheinoculaofsevenofthetubes（markednegative）.Inordertoestimatethenumberoforganismspermlofthesamplewhichwouldcausethiskindofgrowthresponse,welocatethethreesetsoftubeswhichshowdilutionoftheorganisms"toextinction"–i.e.,thosetubeswhichwereinoculatedfromthe10–2,10–3and10–4dilutions.
附 录
1g检样中最近似值（MPN）表（补充件）
以0.1、0.01、0.001g各用3管。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳性管数 ┃ ┃ 阳性管数 ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫MPN
0.10.010.001 ┃ ｜0.10.010.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃＜3 ┃ 2 0 0 ┃9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃15
0 1 1 ┃ 6.1┃ 2 1 1 ┃20
0 1 2 ┃ 9.2┃ 2 1 2 ┃27
0 1 3 ┃ 12┃ 2 1 3 ┃34
0 2 0 ┃ 6.2┃ 2 2 0 ┃21
0 2 1 ┃ 9.3┃ 2 2 1 ┃28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃42
0 3 0 ┃ 9.4┃ 2 3 0 ┃29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6┃ 3 0 0 ┃23
1 0 1 ┃ 7.2┃ 3 0 1 ┃39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃95
1 1 0 ┃ 7.3┃ 3 1 0 ┃43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
LST和EC初步筛选：
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤,每管接种1mL。
将接种管置于36±1℃培养48±2h。
观察试管的产气情况：
检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
附：
LST肉汤、EC肉汤有些什么？
LST肉汤和EC肉汤中有什么？
（发酵乳糖产气）
月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤
EC肉汤
胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase）20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
胰蛋白（月示）或胰酪（月示）20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 4.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）,每管8mL。
121℃高压灭菌15min,最终H6.9±0.1。
EMB平板：
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板,36±1℃培养24±2h。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
附：
怎样进行平板划线分离？
平板划线分离的方法
发布日期：
2010-09-01 浏览次数：
202
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
窗体顶端
窗体底端
平板划线示例
平板划线示例
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2010-09-01 浏览次数：
612
平板划线示例Thisisanexampleofagoodstre
平板划线示例
Thisisanexampleofagoodstreakforisolationusingthe"fourcorners"method.
ThesmallcolonieshereareofStaphylococcusepidermidis
Thisisnotagreatstreakplatebutitisserviceable,asthereareafewisolatedcolonies.Thisplatewouldhavebeenbetteriftheloophadbeenflamedbetweeneachsector.
ThisisanexampleofhowNOTtostreakforisolation.Scribblingisnotstreaking,andmostlikelywillnotresultinisolatedcolonies
Thisplateisolatestwodifferentcolonies:
Escherichiacoli（thecream-colored）colonies,andSerratiamarcescens（theredcolonies）.（粘质沙雷菌）
ThisisaplatewithMicrococcusluteus滕黄微球菌,theyellowcolonies.Whilethisisagoodstreakforisolation,theplatehasbeencontaminated.Thelarge"fuzzy"coloniesarefungalcolonies.
Thelidmayhavebeenliftedtoofarawayfromtheplatewhilestreaking,oradraftmayhavecausedthesporestofallintotheplate.
EMB平板原理及照片
EMB平板照片及原理
发布日期：
2010-05-13 浏览次数：
238
Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue（
Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue（EMB）agar.EMBagarcontainsbilesaltsanddyeswhichinhibitgrowthofgram-positivebacteria.GrowthonEMBagarisausefuldiagnostictooltodistinguishbetweenlactosefermentersandnonfermenterswhichwillappearcolorless.Thisimagecanbeusedtodescribetheuseofmetabolisminidentificationofbacteria.SalmonellaandShigella,bothnonlactosefermentingpathogens,canbedistinguishedfromthemorecommonintestinalflorawhichfermentlactose.
lnfemb-an.jpgLactoseNonfermenteronEMB
PatJohnson,PalmBeachCommunityCollege,LakeWorth,Fla.,USA
窗体顶端
窗体底端
生化试验：
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
1 色氨酸肉汤：
在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
附：
靛基质试验原理及照片
靛基质试验原理及照片
发布日期：
2010-05-13 浏览次数：
290
靛基质（Indole）试验：
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基
靛基质（Indole）试验：
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
试验方法：
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。
Margaret（Peg）Johnson,MesaCommunityCollege,Mesa,Ariz.,USA
Thisimagedepictstheresultsofnegativeandpositiveindoletests.TheindoletestisfrequentlyemployedtodistinguishKlebsiellaorEnterobacterbacteria（indolenegative）fromEscherichiacoli（indolepositive）.ThepresenceofE.coliisusedbypublichealthofficialsasanindicatoroffecalcontaminationoffoodandwatersupplies.
Priortothistest,Enterobacteraerogeneswasusedtoinoculateonetryptonebroth,whileanothertryptonebrothwasinoculatedwithEscherichiacoli.Thetwobrothswerethenincubatedfor24handmixedwithKovasreagent（p-dimethylamino-benzaldehyde）.Tryptonebrothisrichintheaminoacidtryptophan.Tryptophanase,anenzyme,iscapableofcleavingtryptophanandproducingindole,pyruvicacid,andammonia.IndolecanbedetectedbythedevelopmentofaredcolorafteraddingKovasreagent.Organismsthatdonotproducetryptophanasewillbeindolenegative,asnoindolewillbepresenttoreactwiththeKovasreagent
2MR-VP培养基：
在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
附：
MR-VP试验原理及照片
MR-VP试验原理及照片
发布日期：
2010-05-13 浏览次数：
224
甲基红（MethylRed）试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径
甲基红（MethylRed）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
大肠杆菌：
MR+/VP-
3Koser氏枸椽酸盐肉汤：
于36±1℃培养96h记录有无生长。
附：
枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
发布日期：
2010-05-13 浏览次数：
136
枸椽酸盐试验：
某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于
枸椽酸盐试验：
某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。
说明：
SN标准所用培养基是肉汤培养基，且不加指示剂，因此，只能观察是否浑浊生长。
Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 1.5g
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2g
枸椽酸钠（含2H2O） 3.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10mL,121℃高压灭菌15min。
最终pH6.7
±0.2。
4LST肉汤：
于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
5 革兰氏染色：
取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛基质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐┃鉴定（型别）
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌
＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN
值。
第二篇
大肠菌群测定的操作细则（MPN法）
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。
1设备和材料
1.1温箱：
36±1℃。
1.2冰箱:
0～4℃。
1.3恒温水浴:
44.5±0.5℃。
1.4天平。
1.5显微镜。
1.6均质器或乳钵。
1.7平皿:
直径为90mm。
1.8试管。
1.9吸管。
1.10广口瓶或三角烧瓶:
容量为500mL。
1.11玻璃珠:
直径约5mm。
1.12载玻片。
1.13酒精灯。
1.14试管架。
2培养基和试剂
2.1乳糖胆盐发酵管:
按GB4789.28中4.9规定。
2.2伊红美蓝琼脂平板:
按GB4789.28中4.25规定。
2.3乳糖发酵管:
按GB4789.28中4.10规定。
2.4EC肉汤:
按GB4789.28中4.11规定。
2.5磷酸盐缓冲稀释液:
按GB4789.28中3.22规定。
2.6生理盐水。
2.7革兰氏染色液:
按GB4789
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