大肠菌群检测作业指导书.docx
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大肠菌群检测作业指导书
食品中大肠菌群检测作业指导书
1.目的:
规定了本中心大肠菌群(Coliforms)的计数方法.
2.适用范围:
适用于食品中大肠菌群的计数。
3.编写依据:
GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》.
4.术语和定义:
4.1大肠菌群coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。
4.2最可能数mostprobablenumber,MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
5.设备和材料:
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
5.1恒温培养箱:
36℃±1℃
5.2冰箱:
2℃~5℃
5.3恒温水浴箱:
46℃±1℃
5.4天平:
感量0.1g
5.5均质器
5.6振荡器
5.7无菌吸管:
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头
5.8无菌锥形瓶:
容量500mL
5.9无菌培养皿:
直径90mm
5.10pH计或pH比色管或精密pH试纸
5.11菌落计数器
6.培养基和试剂:
6.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LaurylSulfateTryptose,LST)肉汤:
见附录A中A.1
6.2煌绿乳糖胆盐(BrilliantGreenLactoseBile,BGLB)肉汤:
见附录A中A.2
6.3结晶紫中性红胆盐琼脂(VioletRedBileAgar,VRBA):
见附录A中A.3
6.4磷酸盐缓冲液:
见附录A中A.4
6.5无菌生理盐水:
见附录A中A.5
6.6无菌1mol/LNaOH:
见附录A中A.6
6.7无菌1mol/LHCl:
见附录A中A.7
第一法大肠菌群MPN计数法
7.检验程序:
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序
8.操作步骤:
8.1样品的稀释
8.1.1固体和半固体样品:
称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:
10的样品匀液。
8.1.2液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
8.1.3样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
8.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
8.1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
8.2初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
8.3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。
产气者,计为大肠菌群阳性管。
8.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按8.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
第二法大肠菌群平板计数法
9.检验程序:
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2大肠菌群平板计数法检验程序
10.操作步骤:
10.1样品的稀释
按8.1进行。
10.2平板计数
10.2.1选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。
同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
10.2.2及时将15mL~20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。
10.3平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大。
10.4证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
10.5大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以10.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。
例:
10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:
100×6/10×104/g(ml)=6.0×105CFU/g(mL)。
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000mL
pH6.8±0.2
A.1.2制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
A.2煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1成分
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200mL
0.1%煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水 800mL
pH7.2±0.1
A.2.2制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
A.3结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1成分
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂 15g~18g
蒸馏水 1000mL
pH7.4±0.1
A.3.2制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。
煮沸2min,将培养基冷却至45℃~50℃倾注平板。
使用前临时制备,不得超过3h。
A.4磷酸盐缓冲液
A.4.1成分
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
pH7.2
A.4.2制法
贮存液:
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液:
取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。
A.5无菌生理盐水
A.5.1成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000mL
A.5.2制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
A.61mol/LNaOH
A.6.1成分
NaOH 40.0g
蒸馏水 1000mL
A.6.2制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
A.71mol/LHCl
A.7.1成分
HCl 90mL