环境水样品中大肠杆菌及粪耐热大肠杆菌的检测.doc
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环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测
【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用水果湖样点水样）。
本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：
将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，37℃下培养24h，观测结果。
产酸产气为阳性结果，不产酸产气为阴性。
将阳性管中菌液取定量接种于EC肉汤培养液中，45℃下培养24h，观测结果。
产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。
将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，于对应温度下培养24h，镜检。
根据菌落形态和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。
根据大肠杆菌阳性管数的MPN检索可查水样中总大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。
再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》（GB3838-2002）对比，判定水质。
【关键词】环境水样大肠杆菌耐热大肠杆菌多管发酵法最大或然数（MPN）产酸产气
【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，使两种染料结合成复合物，使菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。
耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，由于它多见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。
当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。
【材料与方法】：
（一）材料
乳糖蛋白胨培养液：
蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml（10ml/试管+小倒管20支）
EC肉汤培养基：
胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml（10ml/试管+小倒管10支）
伊红美蓝培养基：
蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml（150ml/瓶）
4.5mL无菌水：
4支
（二）器材
无菌1mL移液管：
4支；
40~200微升移液器、吸气器：
各1支；
200微升无菌Tip：
20只；
载玻片和盖玻片若干；
革兰氏染色各试剂；
培养皿若干套；
酒精灯；
显微镜等
（二）原理及方法
1、样品的稀释和培养：
取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-1样品；再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。
再从10-1、10-2、10-3和10-4样品中各取1ml到乳糖蛋白胨培养基中（每个稀释度样品各5支试管）
2、初发酵实验：
原理：
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。
溴甲还有抑制其他细菌如芽孢杆菌的生长的作用。
方法：
（1）将上述15支试管放入37℃中培养24h；
（2）取出试管观察，若发现试管由紫色变成了黄色，即证明产酸；若发现小倒管中有气泡产生，即证明产气；
（3）记录各试管的产酸产气的情况，将阳性反应（产酸产气）的试管中的样品取一滴（50μ）L转接于EC培养基上，并做好标记。
注：
在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。
48h培养后仍不产酸产气的为阴性反应。
3、45℃培养鉴定：
原理：
37℃下培养产生阳性反应的试管样品不一定是全部都是粪大肠杆菌，经过45℃下培养，若还能产生阳性反应的即可能为粪大肠杆菌（耐热性较好）
方法：
（1）将上一步接种的EC培养基的试管置于45℃下培养24h；
（2）取出试管观察，记录发生阳性反应的试管（产酸并产气）
4、平板分离：
原理：
伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。
方法：
（1）将37℃培养管（48h）和45℃培养中的发生阳性反应的试管中的菌接种于伊红美蓝培养平板，分别再于37℃和45℃的条件下培养过夜。
（2）培养过夜后取出平板，挑选深紫色、具金属光泽，紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色中心颜色较深的菌落。
5、革兰氏染色：
原理：
大肠杆菌为革兰氏染色阴性菌，经过革兰氏染色后在显微镜下显示为红色杆状（有的能观察到芽胞）。
方法：
挑选伊红美蓝培养阳性的菌落，进行革兰氏染色，镜检为红色且无芽胞即为大肠杆菌群。
6、查阅MPN表，得出全部大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最可能数。
【结果与讨论】
1.实验结果记录
1.137℃培养24小时后，10-1、10-2和10-3均产酸产气，为阳性结果；10-4中只有C管产酸产气，其余四管不产酸不产气。
现象
试管号
产酸
产气
10-1
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-2
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-3
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-4
A
—
—
B
—
—
C
+
+
D
—
—
E
—
—
“+”为有此现象，“—”为无此现象。
37℃10-1稀释度
37℃10-2稀释度
37℃10-3稀释度
37℃10-4稀释度
1.2阳性管中样品接种于EC培养基（16管），45℃培养24小时后，10-1、10-2和10-3的A~E管均产浑浊产气，10-4的C管中不产浑浊不产气（A、B、D、E管37℃下为阴性，不接种至45℃）
现象
试管号
产酸
产气
10-1
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-2
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-3
A
+
+
B
+
+
C
+
+
D
+
+
E
+
+
10-4
C
—
—
45℃10-1稀释度
45℃10-2稀释度
45℃10-3稀释度
1.337℃和45℃培养过24小时后的阳性和假阳性管中的菌于伊红美兰平板培养，镜检结果及革兰氏染色结果如下：
试管号
现象
温度
37℃
45℃
菌落颜色
菌体形
状
革兰氏染色
菌落颜色
菌体形状
革兰氏染色
10-1
A
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
B
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
C
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
D
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
E
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
10-2
A
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
B
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
C
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
D
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
紫，无明显金属光泽
短杆状
阴性
E
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
紫，无明显金属光泽
短杆状
阴性
10-3
A
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
B
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
C
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
D
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
E
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
阴性
10-4
A
无菌落
杆状
阴性
B
少量透明菌落
杆状
阴性
C
少量透明菌落（略带紫）
杆状
阴性
D
少量透明菌落
杆状
阴性
E
无菌落
杆状
阴性
伊红美蓝实验37℃
伊红美蓝实验45℃
革兰氏染色结果，依次为阳对，阴对，样品代表
1.4查MPN表结果
45℃时，10-1、10-2、10-3的阳性管数依次为5,5,5。
通过《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T5750.12-2006）查表可知，环境水样品的总大肠菌群数为＞1600MPN/100ml，即＞160000MPN/L。
2.有关该样品水质的判断
根据《中华人民共和国地表水环境质量标准》（GB3838-2002），该样品水质为ⅴ类（粪大肠菌群（个/L）<=40000）。
3.结果分析
（1）实验检测结果表明，取样点（水果湖）的水质为Ⅴ类，属于较差级别类。
我们根据取样点的图片（如下）分析，该处河流浑浊，显棕绿色，且河水流速小，周围植被覆盖少，附近可能有下水道排污口，因此水中大肠杆菌的含量较多。
特别是粪大肠杆菌，能在该环境下进行大量繁殖，造成水体污染。
（2）本实验中，在37℃前三个稀释度的伊红美蓝实验对应的接种区均是白色菌落和紫色金属光泽菌落同时存在，且都不少，而在45℃的三个稀释度的15个接种区里均是深紫带金属光泽。
说明在37℃下还有大肠杆菌之外的别种菌也是优势菌种，而耐热大肠杆菌能耐高温，在45℃下成了唯一的优势菌种，从而白色菌落未出现。
（3）在37℃下显示为阳性的10-4C管在45℃下为阴性，可能的原因有是，那一管中确有大肠杆菌，只是耐热大肠杆菌浓度极低或没有，所以在高温下显示为阴性。
而至于为什么同稀释度其它四管没有此现象，可能是该稀释度的菌液没有混合均匀造成的。
（4）本实验检测的对象为大肠菌群，大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：
需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
【实验感想】
微生物学与我们的生活紧密相关，不仅是因为微生物在现实世界里无处不在，更是因为它们对我们生活的影响表现在与人类及其他生物的方方面面。
与生科院其他实验一样，我们在教学周里不断演练着基本的实验技巧，并在最后的开放实验中将之运用到实际，并解决一些简单的问题，为今后更高层次的科学研究打下基础。
与大一的动生、植生实验不同的是，我们的每一次实验可讨论的东西都更多，需要开始查找大量的文献资料，这是一个生科人的特点，也极大地提高了我们阅读、理解并运用高水平资料的能力。
在论文的海洋里，我们发现了更多与微生物相关的信息，极大地拓宽了我们的视野，激发了我们的兴趣。
——
此次开放实验虽然操作过程较为简单，但却教会我们如何将一份文件真正读懂，并学会实际运用。
我想这就是老师开设此开放实验真正目的。
经过本次对水样品中微生物的含量检测，我们意识到微生物在我们生活中的巨大作用，既有积极方面也有消极方面。
我们可以利用微生物为我们提供很多环境信息，以警示我们周围环境的状况。
环境恶化的罪魁祸首不是我们观测到的微生物，而是我们人类对环境的破坏和没有及时有效地进行改善。
从这么多年对武汉典型地点的水样结果来看，水质改善收效甚微，我们还有很长的一段路要走。
——
刚开始遇到这个实验时，看到资料里讲到的各种数量庞大的仪器、试剂，会担心这个实验会很难做。
但做完才发现，数量庞大是有很强的理论做支撑的，多梯度、高重复本就是科学实验的特点，只是在微生实验中体现得更充分，也与今后的科学研究多梯度、高重复特点更接近。
大量的仪器与药品试剂及高重复的分步实验也考验着我们如何在实验前进行合理规划，如何在实验过程中有条不紊、头脑清醒，如何在实验后进行妥善处理。
因此这个实验对于严谨的科学态度和良好的实验习惯的要求特别突出，也给了我们极大的锻炼。
——
一直都对微生物学实验信心不是很足，尤其是开放实验这种需要连续好几天高密度操作的实验。
但当我进行取样、接种、划线之类的无菌操作以及其他各种开放操作时，我发现经过这一学期的锻炼，其实我已经能够很熟练地进行各种操作了。
谢老师一直强调的熟能生巧我算是领会到了。
而这学期多次以小组为单位的实验操作也使我们小组在这次开放实验中配合得很默契，这也是多次演练的结果。
所以说，在将理论运用于实际之前，在实验室进行大量的个人及小组实验演练，打好基础是从事应用科学研究的良好保证。
——
【致谢】本次实验所需的试管及其他各类仪器材料较为繁多，在此，向谢志雄老师以及所有帮我们准备实验的老师、助教表达我们的谢意。
最后，感谢谢志雄老师及其他老师和助教在这一学期里对我们的教学指导，在微生物实验课上，我们不仅学到了基本的微生物实验操作方法，更学到了科研应有的严谨态度。
感谢老师和助教们。
【参考文献】
[1]《中华人民共和国地表水环境质量标准》（GB3838-2002）
[2]《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T5750.12-2006）
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