CART细胞治疗.docx
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CART细胞治疗
深圳市合一康生物科技有限公司
HYK免疫细胞治疗技术
HYK免疫细胞治疗技术是通过对单个核细胞，在GMP实验室内经过添加细胞因子，使细胞数量扩增、杀瘤活性增强，再通过静脉、介入等方式分次回输给病人，从而激发和增强患者的免疫力，能有效清除微小残留肿瘤细胞，延长生存期，是防止肿瘤术后和放化疗后复发和转移的新方法。
常用的肿瘤免疫细胞手段包括ECIK细胞、DC细胞、DC-CIK细胞、DCIK细胞、T细胞。
HYK免疫细胞治疗的途径有哪些？
HYK免疫细胞治疗的途径可分为静脉注射、皮下注射，瘤体内注射和淋巴结注射。
HYK免疫细胞治疗技术的优势
HYK免疫细胞治疗是20世纪80年代以来随着免疫生物学、肿瘤免疫学和细胞分子生物学的发展而形成的第四种治疗手段，它克服了传统治疗“易转移，易复发，副作用大”的缺点，具有传统治疗无法比拟的优势，具体如下：
低毒：
无明显毒副作用
靶向：
作用方向明确，仅针对体内异常肿瘤细胞进行杀伤，不会破坏正常的组织细胞
全面：
清除微小病灶和残余肿瘤细胞，对原发灶、转移病灶和耐药肿瘤病灶均有疗效，能有效预防肿瘤复发
高效：
增强机体免疫功能，改善症状，提高生存质量，延长生存期。
HYK免疫细胞治疗的适应症：
手术后的肿瘤患者，可防止肿瘤复发转移；
无法进行手术、放疗、化疗的中晚期肿瘤患者；
放疗、化疗失败的肿瘤患者；
肿瘤患者放化疗后的综合治疗，可减轻放化疗的副作用；
骨髓移植后或化疗缓解后的白血病患者；
癌性胸、腹腔积液患者；
部分暂不适宜做手术、介入或其他治疗的患者。
HYK免疫细胞治疗的禁忌症
1、孕妇或者正在哺乳的妇女；
2、T细胞淋巴瘤患者；
3、不可控制的严重感染患者；
4、对IL-2等生物制品过敏的患者；
5、艾滋病患者；
6、正在进行全身放疗、化疗的患者；
7、晚期肿瘤造成的恶病质、外周血象过低患者；
8、器官功能衰竭者；
9、脏器移植者；
10、长期使用或正在使用免疫抑制剂的患者。
ECIK细胞治疗技术
增强型细胞因子诱导的杀伤细胞（Enhancedcytokineinducedkillercell,ECIK）是在普通型CIK的基础上，通过优化培养体系而获得的较CIK细胞数量更多、杀瘤活性更强的细胞。
其通过采集分离到患者外周血中的单个核细胞，在体外用多种进口的细胞因子共同培养而获得的一群异质性细胞，其中以CD3+和CD56+双阳性细胞为主要效应细胞，兼具有T细胞特异性杀肿瘤和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。
E-CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、非MHC限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。
E-CIK细胞除具有普通型CIK细胞的特性外，其显着的特征是增殖能力是普通型CIK细胞的3～5倍，回输的细胞数量达到100亿以上，有利于形成杀瘤的量效优势。
ECIK细胞可以通过多种机制发挥抗肿瘤免疫效应？
1．通过释放穿孔素、颗粒酶等物质直接杀伤肿瘤细胞。
2．通过Fas/FasL途径诱导肿瘤细胞的凋亡。
3．通过分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6等多种细胞因子，发挥直接或间接的抗肿瘤免疫效应。
ECIK细胞抗肿瘤免疫治疗的优势？
1．ECIK细胞增殖速度快，可以在短期内大量扩增，满足临床治疗的需要。
2．ECIK细胞具有特异性识别肿瘤细胞的机制，对正常细胞无毒副作用。
3．ECIK细胞杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药肿瘤细胞同样敏感。
4．ECIK细胞杀瘤活性不受CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）等免疫抑制剂的影响。
5．ECIK细胞是活化的自体细胞，安全性好，不会产生排斥等反应，副反应小。
ECIK的治疗范围
ECIK细胞能治疗哪些肿瘤？
由于ECIK细胞对任何一种肿瘤均有杀伤作用，在多种肿瘤的治疗中展示了应用前景。
如各种肉瘤、黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肾癌、非何杰金氏淋巴瘤及高分化腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、消化道肿瘤（如胃癌、结肠癌、食道癌）、胰腺癌、喉癌、头颈部肿瘤、淋巴瘤（T细胞淋巴瘤除外）、白血病、多发性骨髓瘤等。
有些肿瘤，如各种肉瘤、黑色素瘤、肾癌、非何杰金氏淋巴瘤及高分化腺癌等对放化疗不敏感，因此ECIK细胞是这些肿瘤的首选。
ECIK细胞治疗可用于哪一阶段（期）的肿瘤？
ECIK细胞治疗可用于任何一期的肿瘤患者，早期、中晚期的病例均有较好的近期疗效。
手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗的同时或治疗后的病人疗效更佳。
ECIK细胞能够杀伤清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的肿瘤细胞，起到延缓或阻止肿瘤的转移或复发的作用。
部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的患者，也可以先进行免疫细胞治疗，提高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。
DiKaT细胞治疗技术
载瘤抗原树突状细胞（Tumorassociatedantigen-Dendriticcell,TAA-DC）激活CIK及特异T细胞整合技术（IntegrateddendriticcellinducedkillercellandTcell,DiKaT），根据病人HLA-a2分型检测阳性的病人，选用病人肿瘤相应的特异性抗原（TSA）负载DC，并分别用DC来激活病人的CIK、T细胞，DiKaT技术是综合了DC疫苗、CTL细胞治疗等技术，进行序贯联合设计的一种个性化细胞治疗技术。
DiKaT技术采用多种免疫细胞联合作用，克服了单一免疫细胞治疗的局限性，结合了特异性杀伤和非特异性杀伤肿瘤细胞的效果，可全面提高病人的免疫功能，对免疫原性较强的肿瘤效果更好。
另外接受本治疗前必须进行HLA-a2分型检测，检测结果阳性患者适合该技术治疗。
γδT细胞治疗技术
γδT细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，主要分布于皮肤和粘膜组织，一般不超过T细胞总数的5%。
活化后的γδT细胞具有强大的特异性和非特异性杀伤肿瘤细胞的双重特性，此外γδT细胞还具有DC的抗原递呈能力，可高效激活T细胞形成CTL细胞；HYK的专利技术能在体外高效扩增γδT细胞，从而解决有效细胞量不足和DC抗原递呈细胞无法扩增的缺点。
D-CIK细胞治疗技术
树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞（Dendriticcellactivatedandcytokineinducedkillercell,D-CIK），是将人体外周血单个核细胞分别诱导培养成DC和CIK细胞，DC培养成熟后再与CIK细胞共培养而获得的异质性细胞群体。
二者共培养时，T细胞促使DC进一步成熟后释放大量IL-12、IFN-γ等细胞因子，使CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性明显增强，CIK细胞扩增倍数上升；DC分泌高水平的IL-2、IL-12诱导Th1型细胞免疫应答，有利于清除肿瘤细胞，达到1+1>2的效果。
一、TIL细胞治疗技术
肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte,TIL细胞）是一群存在于肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，一般从肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中分离出的淋巴细胞经IL-2培养得到，其肿瘤杀伤活性为MHC限制性，即为自体肿瘤特异性杀伤细胞，具有CD3+CD8+或CD3+CD4+表面标志。
TIL细胞对癌性胸、腹腔积液患者疗效显着。
TIL细胞治疗肿瘤的优点
增殖性及杀伤性强；
IL-2量用量小；
取材于肿瘤组织。
对癌性胸水和腹水治疗效果较好。
二、CTL细胞治疗技术
CTL细胞技术
CTL（cytotoxicTlymphocyte）细胞即细胞毒性T淋巴细胞，它在T细胞免疫应答中起重要作用。
CTL的功能特点是可以在MHC限制的条件下，直接、连续、特异性的杀伤靶细胞。
CTL对靶细胞的杀伤过程可以分为三个时相：
（1）接触相：
CTL通过TCR及粘附分子与靶细胞接触。
此过程只需要几分钟。
（2）分泌相：
CTL与靶细胞紧密结合，CTL活化并使细胞颗粒性内容物呈现极化分布，随即启动胞吐机制，分泌细胞毒性物质，作用于靶细胞。
（3）裂解相：
靶细胞死亡的过程。
CTL的杀伤特点：
（1）杀伤力强；
（2）反复杀伤靶细胞，而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤；（3）MHC限制性。
CTL的杀伤机制：
（1）穿孔素：
穿孔素以单体形式释放后，插入靶细胞膜，形成管状多聚穿孔素（孔道），容许Na+和水分子进入靶细胞，使靶细胞渗透压改变，最终导致靶细胞溶解。
（2）颗粒酶：
CTL细胞通过胞吐作用释放的颗粒酶，可通过穿孔素构建的管状结构穿越靶细胞膜进入其胞浆中，激活caspase10（半胱天冬氨酸蛋白酶10），引发caspase级联反应，使靶细胞凋亡。
（3）肿瘤坏死因子：
包括TNFα-和TNF-β，它们可以与靶细胞表面的相应的受体结合，启动靶细胞的凋亡。
CTL疗法
1.Tc细胞简介
CD8+T细胞又称细胞毒性T（Tc或CTL）细胞，能直接攻击带异抗原的靶细胞，因此在抗病毒感染、同种异体移植排斥反应和抗肿瘤免疫中起重要作用。
2.Tc细胞的作用机制
Tc细胞对靶细胞的杀伤作用是抗原特异性的，只杀伤相应靶细胞而对其它细胞无损伤作用。
Tc细胞杀伤靶细胞的过程分为两个阶段。
（1）效靶细胞结合阶段
Tc细胞到达抗原所在部位后，通过TCR-CD8复合物与靶细胞表面抗原肽-MHCI类分子复合物紧密结合，并在多种粘附分子、细胞因子等参与下，完成复杂的识别、粘附、信号传递等过程，触发细胞活化释放溶细胞介质。
（2）致死性打击阶段（杀伤主要机制）
Tc细胞主要通过三种方式杀伤靶细胞。
①穿孔素-颗粒酶系统途径
Tc细胞释放颗粒中预先合成的穿孔素和颗粒酶。
穿孔素以单体形式释放后，插入靶细胞膜，形成管状多聚穿孔素（孔道），容许Na+和水分子进入靶细胞，使靶细胞渗透压改变，最终导致靶细胞溶解。
另一方面为颗粒酶进入靶细胞提供通道。
颗粒酶是一类丝氨酸酯酶，具有核酸酶效应。
从颗粒中释放后经多聚穿孔素进入靶细胞，在靶细胞内触发引起DNA断裂的机制，导致靶细胞调亡。
由于颗粒中的物质是预先合成的，所以这一途径引起的杀伤是非常迅速的。
效应细胞颗粒中储存的穿孔素和颗粒酶数量使得一个效应细胞足以连续杀伤许多细胞。
②FasL/Fas系统途径
效应Tc细胞杀伤靶细胞的另一种方式是通过与靶细胞的直接接触，活化的CTL膜上表达FasL，它与靶细胞膜上的Fas结合，导致靶细胞调亡。
③细胞因子途径
效应Tc细胞分泌TNF-α和TNF-β，杀伤靶细胞。
3.Tc细胞的临床应用
Tc细胞在抗肿瘤和抗病毒性感染（如肝炎）治疗方面有很好的应用。
Tc细胞是杀伤白血病细胞的关键性效应细胞，因而将体外诱导并扩增的白血病细胞特异性Tc细胞回输给患者，是一种有效的白血病治疗方法。
精密制导、精准打击的抗癌生物导弹
——合一康CAR-T技术
技术背景：
生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段——2012年国际细胞治疗协会年会。
免疫细胞治疗是采集患者外周静脉血，在GMP实验室内分离外周血单个核细胞，在多种细胞因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的免疫效应细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体内，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的，常用的免疫细胞治疗手段包括CIK、DC、TIL、DC+CIK细胞等。
但是，在临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，DC细胞功能受损，激活T细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。
这就需要制造精密制导、精准打击的免疫细胞武器，克服MHC介导的杀瘤机制。
于是，靶向性抗肿瘤细胞CAR-T技术应运而生。
2011年8月10日，美国《生物转化医学》和《新英格兰医学期刊》权威杂志报道，宾夕法尼亚大学基因治疗专家卡尔·朱恩利用患者改造后的自身T细胞治愈了两位晚期慢性淋巴细胞白血病（血癌）患者，开创了肿瘤生物治疗的新纪元。
美国科学家们对以往的治疗方式做了一点小改动：
首先抽出患者体内的部分T细胞，在体外进行了基因改造，导入识别肿瘤的基因，形成识别肿瘤的“记忆”，并在体外短时间内大量繁殖，最后回输到病人体内，长期待续杀灭全部恶性肿瘤细胞。
治疗进行得非常成功，一名不愿透露姓名的64岁病人在接受T细胞植入仅仅23天后，体内的癌细胞奇迹般的全部消失了。
一年之后，其中两位体内的癌细胞均已全部杀灭，另外一位受试者体内的白血病细胞数量也大幅度减少。
CAR-T技术原理：
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体（CAR）。
患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。
图一
第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体（singlechainfragmentvariable，scFv）和免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM，通常为CD3-ζ和FcεRIγ）组成。
早期的实验证明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。
依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号；
第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信号序列（costimulatorymolecule，CM），旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放（如图二）。
图二
CAR-T技术优势：
CAR-T细胞治疗技术具有如下优势：
·治疗更精准。
由于CAR-T细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁；
·多靶向更精准。
CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制；
·杀瘤范围更广。
鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；
·杀瘤效果更持久。
新一代CAR结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，能保证T细胞进入体内后还可以增殖，CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
卡尔·朱恩说，这些T细胞的好处在于不必像化疗药物那样持续给药，细胞是“活的、动态的、不断分裂的药”，一次注射，持久保护，这种前沿肿瘤生物治疗技术让全球的科学家们震惊。
合一康CAR-T技术
合一康生物通过选择不同的共刺激分子及其组合，优化CAR的结构，成功构建了基于慢病毒载体转染体系的靶向特定肿瘤抗原的第三代CAR，掌握了新一代高效、精确、可控的CAR-T细胞治疗技术。
同时，合一康生物联合中科院深圳先进技术研究院成立了肿瘤免疫细胞与基因治疗技术联合实验室，积极寻求更为安全的基因修饰载体，开发出了基于微环DNA（MC）技术的MC-CAR-T细胞治疗技术。
微环DNA是世界上最好的基因载体，与现有的基于病毒载体的技术相比，具有转染率高、基因表达持久的优点、同时具有非病毒载体毒性低、免疫反应低，携带基因不整合至宿主细胞基因组等优点。
由此，可以发展出一系列安全、高效、广谱的、可负担的抗癌产品，成为治疗几乎所有癌症的利器。
产业化的实施将大大降低治疗的成本，提高治疗的效果，不仅可以彻底治愈癌症，甚至可以将人类带入到一个无癌的世纪。
合一康CAR-T技术适应症
·适用条件
一、肿瘤标志物或免疫组化检测的某种或数种肿瘤相关抗原为阳性（参见《肿瘤患者筛选标准》）；
二、肿瘤组织的HLA-Ⅰ类抗原阳性；
三、停止化疗或放疗，外周血细胞恢复至正常值或接近正常值（使用升白细胞药物达到的正常值除外）；
四、无重度贫血，全身器官衰竭和恶病质状态；
五、肝肾功能正常，生命体征基本正常；
六、无严重过敏体质；
患者符合以上条件即可接受合一康CAR-T技术治疗。
·适用治疗
⑴早期患者术中或术后的治疗
⑵晚期患者放化疗同时治疗或放化疗后的序贯治疗
⑶晚期患者的独立治疗
合一康CAR-T技术应用范围广泛，针对某种或数种肿瘤相关抗原阳性的肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤均可治疗。
第二篇
CAR-T技术原理
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体（CAR）。
患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。
图一
第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体（singlechainfragmentvariable，scFv）和免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM，通常为CD3-ζ和FcεRIγ）组成。
早期的实验证明了CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。
依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号。
第二代、第三代CAR引入了共刺激分子信号序列（costimulatorymolecule，CM），旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放（如图二）。
图二
CAR-T技术优势
CAR-T细胞治疗技术具有如下优势：
·治疗更精准。
由于CAR-T细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁；
·多靶向更精准。
CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制；
·杀瘤范围更广。
鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；
·杀瘤效果更持久。
新一代CAR结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，能保证T细胞进入体内后还可以增殖，CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
卡尔·朱恩说，这些T细胞的好处在于不必像化疗药物那样持续给药，细胞是“活的、动态的、不断分裂的药”，一次注射，持久保护，这种前沿肿瘤生物治疗技术让全球的科学家们震惊。
CAR-T技术治疗肿瘤的适应症
·适用条件
一、肿瘤标志物或免疫组化检测的某种或数种肿瘤相关抗原为阳性（参见《肿瘤患者筛选标准》）；
二、肿瘤组织的HLA-Ⅰ类抗原阳性；
三、停止化疗或放疗，外周血细胞恢复至正常值或接近正常值（使用升白细胞药物达到的正常值除外）；
四、无重度贫血，全身器官衰竭和恶病质状态；
五、肝肾功能正常，生命体征基本正常；
六、无严重过敏体质；
患者符合以上条件即可接受合一康CAR-T技术治疗。
·适用治疗
⑴早期患者术中或术后的治疗
⑵晚期患者放化疗同时治疗或放化疗后的序贯治疗
⑶晚期患者的独立治疗
合一康CAR-T技术应用范围广泛，针对某种或数种肿瘤相关抗原阳性的肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤均可治疗。
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