微生物检测标准操作规范剖析.docx

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微生物检测标准操作规范剖析

陕西爽爽佳食品有限公司

微生物检测标准操作规范

文件号：

SSJ-SOP-PK-004A/0颁布日期：

2017年4月14日

文件类型：

SOP密级：

仅供内部使用

编写人：

日期：

年月日

审核人：

日期：

年月日

签署人：

日期：

年月日

序号

修改日期

修改页

修改信息摘要

审批人

1.0目的

确保微生物检测的准确和规范，较真实地反映测试样品的微生物状况。

2.0范围

具体见各检测方法。

3.0职责

3.1微生物品控员负责本SOP的具体操作。

3.2品控主管负责本SOP执行的有效性.

4.0定义

无

5.0程序

目前微生物检测方法主要分两种：

薄膜过滤法和倒平板法。

另附大肠杆菌国标法（附件2）和用过的微生物测试材料的处理规范（附件3）。

5.1薄膜过滤法。

此方法适用于较容易过滤的样品的微生物测试，如常规水、包装饮用水、天然矿泉水、碳酸饮料等。

5.1.1培养基的准备

5.1.1.1培养基的具体配制方法见附件1或产品包装说明。

5.1.1.2倒平板

将47mm带吸附垫培养皿包装带外表面用75%酒精喷杀，放入超净工作台内。

在工作台内撕开包装，取出培养皿，备用。

注：

此步中，由于培养皿为无菌包装，每次使用前估计好所需的培养皿数，尽量做到取多少用多少。

无菌操作缓缓将培养基倒入培养皿中，倒入量不宜过多，以充分湿润但倾斜不出现明显积液为佳。

注：

由于培养皿较小，操作不太方便，整个操作需缓慢，且双手杀菌需彻底，避免因倒平板而引起污染。

5.1.2膜过滤

5.1.2.1解开已消毒的漏斗备用（开口不宜过大）。

5.1.2.2用火焰枪烧灼滤头，完毕将膜放置于滤头中央，套上经火焰迅速灭菌的漏斗。

5.1.2.3以无菌方式倒入样品，施加真空进行抽滤，此时需观察样品剩余量，空抽时间不得长于10秒，但尽量避免空抽。

5.1.2.4移去漏斗，无菌操作将膜接种于准备好的培养皿中。

5.1.3样品培养

5.1.3.1为了避免在滤膜表面形成冷凝水，所有培养皿必须倒转放在培养箱中。

5.1.3.2在培养箱里放一个装有水的烧杯，以保持一定的湿度。

5.1.3.3下面的温度是最佳培养温度:

总菌数：

35C

酵母和霉菌：

25C

大肠杆菌：

35C

如果共用一个培养箱,则把温度调节至30±2ºC。

5.1.4菌落数的计算

5.1.4.1细菌总数

必须在48小时之后计算总菌数（成品需分别记录24小时、48小时、72小时的菌落数）。

计算所有菌落数（不管种类）。

5.1.4.2酵母和霉菌

⏹在培养72小时,96小时,120小时后点计酵母和霉菌数，记录最高的数目。

⏹酵母和霉菌通常表现为圆的白色菌落，虽然有时也会出现颜色，在36－48小时之后，一些白色酵母菌由于吸收了介质中的指示剂而会在菌落中央逐渐显现蓝色。

⏹霉菌菌落有许多种颜色（如白、黄、红、蓝、黑），但由于外观呈现细绒毛状或棉絮状，所以容易辨认。

通常霉菌菌落大于细菌或酵母菌的菌落。

如果霉菌菌落在平皿上呈曼延的状态，则记录为“Spreaders”。

5.1.4.3细菌菌落通常吸收指示剂要比酵母菌快，可变为蓝色、绿色、蓝绿色或褐色。

在这种培养基中，细菌菌落通常比酵母菌菌落小。

5.1.4.4大肠杆菌

在35C温度下培养的大肠杆菌菌落是绿色或墨绿色，有强烈反射性的金属光泽。

在24小时后计算有“光泽”的菌落。

观察大肠杆菌菌落的金属光泽时可将滤膜倾斜到一个角度，使入射光在具有特殊金属的菌落同没有这种光泽的菌落之间产生鲜明的对比。

5.2倒平板法

适用于果汁或含果汁饮料、咖啡、非纯茶饮料等难以进行膜过滤检测的样品。

5.2.1培养基的准备

5.2.1.1培养基的具体配制方法见附件1或产品包装说明。

5.2.2培养皿的准备

将烘干后的平皿装入消毒筒内160℃120min（若时间紧急也可设定为170℃60min）进行干热灭菌，冷却备用。

5.2.3接种

准备样品所需的培养皿个数，并一一作好标记，以无菌操作手法接入一定量（常规样品均为5ml）的样品至培养皿中（细菌总数和霉菌/酵母各一个平板）。

5.2.4倒平板

如果培养基灭菌后当天使用，将灭菌后的培养基放入502C水浴中待用。

如果不是当天使用，让培养基凝固，冷藏保存。

使用之前用沸水或蒸汽溶解灭菌培养基。

注意保证培养基不能过热。

培养基一经溶化，将培养基放于502C水浴中。

温度未平衡之前不要使用培养基。

5.2.4.1用燃烧灭菌方法打开装有培养基的瓶子或测试管。

打开每个已接种的培养皿盖，轻轻加入约15ml培养基到培养皿中。

5.2.4.2盖上盖子，将培养皿按8字图案转动使里面的物质混合。

在混合过程中，必须注意防止培养基溅至培养皿边缘或盖上。

每个测试项目取个平板，直接加入约15ml培养基作为空白对照。

5.2.4.3让培养基凝固，然后倒转平皿，在适当的温度下培养。

5.2.5样品培养和菌落计数（同薄膜过滤法）

6.0参考文献

无

7.0附件/记录

7.1附件

培养介质的配制及灭菌表

国标

用过的微生物测试材料的处理规范

7.2记录

微生物检测原始记录表

附件1：

培养介质的配制及灭菌表

测试项目

介质名称

供应商名称

配制方法

灭菌方法

细菌总数

18g溶于1升蒸馏水或去离子水中

121~124ºC,15分钟

酵母和霉菌

7.3g溶于100ml蒸馏水或去离子水中

121ºC,10分钟

大肠杆菌

48g溶于1升蒸馏水,加上20ml无水乙醇

无需高温灭菌，加热到沸腾即可

细菌总数

17.5g溶于1升蒸馏水中，搅拌加热至完全溶解

121ºC，15分钟

细菌总数

37g溶于1升蒸馏水中，搅拌加热至完全溶解，经高温灭菌后需使用消毒后的10％的酒石酸调节PH

121ºC，15分钟

大肠菌群

40g溶于1升蒸馏水中，搅拌加热至完全溶解

121ºC，15分钟

附件2：

大肠杆菌国标法

1.0目的

检测食品饮料中的大肠菌群，以监测饮料的微生物状况。

2.0范围

适用于咖啡饮料，茶饮料等产品的大肠菌群的测定。

3.0职责

微生物品控员负责本文件的执行；QA检验工程师负责监督本文件的有效执行。

4.0定义

大肠菌群:

系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

MPN:

大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

5.0设备及试剂

培养箱:

361C显微镜

平皿:

直经为90mm试管,试管架

三角烧瓶载玻片

生理盐水乳糖胆盐发酵管

伊红美蓝琼脂乳糖发酵管

革兰氏染色液

6.0程序

6.1培养介质的准备

所有培养剂必须根据制造商的说明进行制备和灭菌。

它们对热很敏感，所以不能过热。

培养剂应装入相应的容器内进行灭菌，容器中至少保留15％的空间。

6.2操作步骤

6.2.1检样稀释及培养

6.2.1.1以无菌操作，将检样10g或10ml放于含有90ml生理盐水的玻璃瓶内经充分振摇作成1:

10的均匀稀释液。

6.2.1.2用1ml灭菌吸管吸到1:

10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成1:

100的稀释液

6.2.1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

6.2.1.4由于本方法所适用的样品均要求无菌，因此只选择原液、1:

10和1:

100两个稀释度，分别作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌的乳糖胆盐发酵管内（已按待测样品的类别和批号分别作好记号），每个稀释度接种三个发酵管。

6.2.2乳糖发酵试验

将接种了样品的乳糖胆盐发酵管置361ºC培养箱内，培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行

6.2.3分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361ºC温箱内，培养482h，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

6.2.4证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361C培养箱内培养242h,观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

6.2.5报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，在“GB4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群的测定”中查MPN检索表，报告每100ml大肠菌群的最可能数，并将结果记录在“微生物检验记录”上。

7.0参考文献

本文件参考:

GB4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群测定。

附件3：

用过的微生物测试材料的处理规范

1.0目的

保证工作区域不受废弃物品的微生物污染。

2.0范围

适用于所有微生物测试后的物品。

3.0职责

微生物品控员负责本文件的执行，领班负责监督本文件的有效执行。

4.0程序

4.1已用过的薄膜和培养剂的放置和处理不得在微生物工作区域内进行.

4.2没有微生物生长的玻璃培养皿，将培养剂取下，煮沸后废弃。

将培养皿用清洁剂清洗干净，烘干待用。

4.3有微生物生长的玻璃培养皿，应将培养皿及培养剂一起在121C下杀菌釜消毒30分钟，然后再将培养皿清洗干净。

4.4有微生物生长的塑料培养皿、薄膜吸收垫和培养剂，应在121C下杀菌釜消毒30分钟，然后废弃。

4.5没有微生物生长的滤膜和吸收垫则可煮沸或用高浓度氯水浸泡后废弃，塑料培养皿，用冷灭菌的方法加以灭菌。

4.5.1将培养皿清洗干净后，用200ppm氯水浸泡2～3小时，然后冲洗干净。

4.5.2待培养皿干后，置于装有75％酒精的容器中浸泡一夜（不少于14小时）。

4.5.3用火焰燃烧过的钳子取出培养皿，倒放在紫外杀菌柜中已消毒的毛巾上，打开紫外灯，将培养皿晾干。

酒精蒸发完后，关闭紫外灯，装好培养皿备用。