《分子生物学》实验17课时.docx

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《分子生物学》实验17课时

DNA分子。

在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭（ethidiumbromide,EB），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。

本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

三、实验用品

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、移液枪及配套枪头、点样板或保鲜膜、一次性手套、100ml或250ml锥形瓶、量筒等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：

2mol/LTris-乙酸，0.05mol/LEDTA（pH8.0）

配制1000ml

Tris242g

冰乙酸57.1ml

0.5mol/LEDTA100ml

加入600ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1L后。

高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20ml的50×TAE缓冲液，再加入980ml的去离子水。

溴化乙锭贮存液：

10mg/ml溴化乙啶

配制：

100ml

称取1g溴化乙啶，置于100ml烧杯中，加入80ml去离子水后搅拌溶解。

将溶液定容至100ml后，转移到棕色瓶中。

室温保存。

6×上样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：

10ml

溴酚蓝25mg

二甲苯青FF25mg

甘油3ml

用6×TAE缓冲液定溶至10ml，分装成1ml/管。

-20℃保存。

其它试剂：

DNA样品、DNALadder、琼脂糖

四、实验方法

1.制备1％琼脂糖凝胶（50ml）：

称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。

微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2.胶板制备：

取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。

取少量琼脂糖凝胶液将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。

将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。

将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。

室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。

添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3.加样：

在保鲜膜上混合8.3μl质粒DNA样品和1.7μl上样缓冲液，用10μl移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。

（注意：

加样前要先记下加样的顺序）。

4.电泳：

加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60－100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。

电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。

当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5.电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20min，再用清水漂洗10min。

6.观察照相：

在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

7.常见问题及注意事项

1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。

2.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。

3.电泳时应注意电源线路，预防触电。

4.溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。

并在专门的实验室内使用。

5.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。

6.DNA带形状模糊：

DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。

7.质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。

因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：

cccDNA>线状DNA>ocDNA。

五、实验结果

在紫外仪中观察电泳荧光区带，并拍照、分析。

实验四pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增与试剂盒抽提（碱抽提法）

一、实验目的

学习并掌握在宿主菌中扩增质粒的理论依据与操作方法。

了解大肠杆菌质粒提取的原理和方法，掌握小量快速提取法（试剂盒法）。

二、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

基因工程用质粒都带有选择性标记序列，最常用的的选择性标记是对抗生素的抗性基因。

如本实验所使用的质粒（pET28a），即带有抗卡那霉素（Kanr）抗性基因。

当培养中含有卡那霉素时，宿主（大肠杆菌BL21）的蛋白质合成受到抑制，而pET28a质粒可自行复制，从而将大大增加拷贝数，达到抽提质粒的浓度要求。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：

①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。

在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

图1pET-28a质粒基因结构简图

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

三、实验用品

①仪器及耗材：

37℃恒温摇床、台式离心机、恒温水浴锅、移液枪及配套枪头、记号笔、烧杯、冰盒、酒精灯、打火机、计时器；

50ml离心管、1.5ml离心管、离心管架、蓝盖试剂瓶、大试管、100ml三角锥瓶、250ml三角锥瓶、玻棒等；

3S柱离心式质粒小量抽提试剂盒

②实验材料：

大肠杆菌BL21，含pET28a质粒。

③试剂及配制：

LB培养液的配制：

酵母粉5.0g；

蛋白胨10.0g；

NaCl10.0g；

依次称量后加入800ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5mol/LNaOH调节培养液的pH值至7.0。

再加去离子水将溶液定容至总体积为1000ml，高压蒸汽灭菌25min，冷却后4℃保存。

卡那霉素：

50mg/ml，配制后抽滤灭菌，分装，-20℃冻存。

溶液Ⅰ（GET缓冲液）：

25mmol/LTris-HCl（pH8.0）,10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖

配制：

1000ml

1mol/LTris-HCl（pH8.0）25ml

0.5mol/LEDTA（pH8.0）20ml

20%Glucose（1.11mol/L）45ml

dH2O910ml

将以上溶液混合装瓶，10磅高压灭菌20min，冷却后4℃保存。

溶液II（变性液）：

200mmol/LNaOH，1%SDS

配制：

500ml

10%SDS50ml

2NNaOH50ml

取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500ml，充分混匀。

室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。

注意：

SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

溶液III（醋酸钾液）：

3mol/L醋酸钾（KAc）缓冲液，pH5.6。

5mol/L冰醋酸

配制：

500ml

醋酸钾147g

冰醋酸57.5ml

加入300ml去离子水后搅拌溶解。

待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500ml。

高温高压灭菌后，4℃保存。

10×TE缓冲液（pH8.0）：

100mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA

配制：

1000ml

1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）100ml

500mmol/LEDTA（pH8.0）20ml

加入约800ml的去离子水，均匀混合。

溶液定容至1L。

高温高压灭菌后，4℃保存。

苯酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1）：

将量取25mlTris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它试剂：

TE（pH8.0）、异丙醇、氯仿/异戊醇（24:

1）、无水乙醇、70％乙醇

四、实验方法

（一）pET28a质粒在大肠杆菌中的扩增

1.菌种活化：

将50mlLB培养基加入到250ml三角锥形瓶中，加入卡那霉素50μL，然后接入一单菌落（携带pET28a的大肠杆菌BL21菌株），并保持通气良好，于37℃220rpm振荡培养过夜（约16h），如有必要可以再转接一次，于37℃220rpm振摇培养3～4h。

2.菌液转接：

取灭菌后的50ml三角锥形瓶一支，加入15mlLB培养基和15μL卡那霉素，接种菌液250μL，于37℃恒温振荡器中220rpm振摇培养。

3.培养过夜后，收集所培养的菌体，用于质粒抽提。

（二）质粒DNA提取（碱裂解法）

用3S柱离心式质粒小量抽提试剂盒抽提，以试剂盒使用说明为准

1.将过夜培养的1ml细菌转移至1.5ml离心管，高速（15,000转/分钟）离心5分钟，彻底去除上清。

重复1次。

2.加入100μlSolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

3.加入200μlSolutionII，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置（2分钟左右）至溶液变成澄清。

4.加入400μlSolutionIII，立即上下颠倒5－10次，使之充分中和，室温放置2分钟。

（注意：

步骤2和3在冰上操作效果更佳。

）

5.高速离心，15,000转/分钟，10分钟。

无需低温离心。

6.取出2ml样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到（吸或倒入）3S柱子里。

盖上离心管盖子，室温放置2分钟；用台式离心机室温高速（15,000转/分钟）离心2分钟。

7.取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700μlWashSolution到3S柱，高速离心2分钟。

8.重复步骤7一次。

9.取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，高速离心5分钟。

10.将3S柱放入干净的1.5ml的离心管（预先写好标签）中，在3S柱子膜中央加50μlTE或水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心3分钟。

11.弃3S管。

保留1.5ml离心管，盖好离心管盖，存放于-20℃保存备用。

附：

自制抽提液碱裂解法操作

1.吸取培养的菌液1ml，转入1.5ml的离心管中，用台式离心机以12000rpm离心3min。

弃上清。

在管内再次加入菌液1ml，离心，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

2.加100μl溶液Ⅰ重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。

3.加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。

室温静置5min（溶液变透明，粘稠）。

4.加150μl溶液Ⅲ，轻微振荡混和10sec，置冰上10min（溶液出现白色沉淀）。

5.12000rpm离心6min，取上清液至另一离心管（弃沉淀）。

6.加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀1min，12000r/min离心6min，取上清液至另一离心管。

7.加1倍异丙醇，振荡混匀，静置10min，12000rpm离心6min。

弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

8.加200μl70％乙醇洗涤沉淀物，台式离心机12000rpm离心2min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。

9.沉淀加20μlTE,反复吹打使质粒DNA充分溶解，－20℃保存。

五、实验结果

将所抽的质粒存放于4℃冰箱中备用。

六、思考与讨论

如果要在此pET28a质粒中放入外源重组基因，该如何选择插入位点？

常见问题：

1.提取的质粒DNA不纯：

变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。

2.提取的质粒DNA呈涂布状：

操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。

3.与染色体DNA分离不全：

变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或pH）。

实验五感受态细胞的制备（CaCl2法）

一、实验目的

了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理，掌握制备方法。

二、实验原理

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。

三、实验用品

①材料：

大肠杆菌TOP10

②设备器材：

超净工作台、冷冻离心机、恒温摇床、冰箱、恒温水浴锅、分光光度计、移液枪（1000μl、100μl）及相配枪头、离心管（1.5ml、10ml）、离心管架、记号笔、计时器、锥形瓶、冰盒、温度计。

③试剂：

LB液体培养基

0.05mol/lCaCl2溶液：

称取0.37gCaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。

含15%甘油的0.05mol/lCaCl2：

称取0.37gCaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。

四、实验步骤

（一）受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。

将该菌悬液以1：

100-1：

50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。

（二）感受态细胞的制备（CaCl2法）

1）、在超净台上将8ml培养液转入10ml离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。

2）、在超净台上弃去上清，用预冷的0.05mol/l的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。

3）、在超净台上弃去上清，加入400μl预冷含15%甘油的0.05mol/l的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。

4）、在超净台上将感受态细胞分装成200μl的小份（分装2份至1.5ml离心管中），贮存于-70℃（可保存半年）。

五、实验结果

将制备好的感受态细胞暂存于-20℃，用于转化实验。

六、注意事项

防止杂菌与杂DNA污染，整个操作过程应在无菌条件下进行，所用器皿、试剂均需灭菌，并注意防止被其它试剂、DNA酶、杂DNA所污染。

实验六pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10与鉴定

一、实验目的

以pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10为例，学习转化的基本原理及方法。

二、实验原理

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（CompenentCells）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。

本实验是用pET28a质粒来转化已制备成感受态的大肠杆菌TOP10，所用方法为CaCl2转化法。

pET28a质粒上含有一个抗生素卡那霉素抗性基因，转化子细胞将在含有卡那霉素的培养基上生长而非转化子细胞则不能，故而用抗性平板作为筛选培养基，涂布鉴定的方法即可筛选出转化子。

三、实验用品

①材料：

感受态大肠杆菌TOP10细胞、pET28a质粒

②器材与设备：

超净工作台、冰箱、恒温培养箱、恒温振荡器、移液枪（100μl、1000μl）及相配枪头、1.5ml离心管、离心管架、记号笔、涂布棒、计时器、冰盒、温度计、封口膜、浮板、培养皿。

③试剂：

液体LB培养基

平板培养基（卡那霉素+）：

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入卡那霉素储存液，终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。

四、实验步骤

（1）从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

（2）在细胞液中加入pET28a质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

（3）42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

（4）向管中加入1mlLB液体培养基（不含Kan），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Kanr）。

（5）将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

*同时做两个对照:

对照组1:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取10μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

**计算转化率：

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）

感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

[注意]本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。

但它们的转化效率并不一定一样。

有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心）,才能较准确的计算转化率。

五、实验结果

观察筛选培养基上的菌落，并进行统计、分析。

六、注意事项

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。

1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。

一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

防止杂菌与杂DNA污染。