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论文
石河子大学毕业论文
题目：
大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌活性的研究
院（系）：
化学化工学院
专业：
环境工程
学号：
姓名：
指导教师：
完成日期：
2014年06月
目录
摘要：
II
AbstractIII
第一章文献综述1
前言1
1.大黄1
1.1大黄的种类和分布1
1.2大黄的化学成分2
1.3大黄酸的来源及性质2
1.4大黄酸及其Cu、Al配合物的结构特征3
2.大黄酸及其Cu、Al配合物的研究与应用4
2.1大黄酸及其Cu、Al配合物在抑菌领域的研究与应用4
2.2大黄酸及其Cu、Al配合物在医药上的应用6
2.2.1大黄酸及其Cu、Al配合物的降糖降脂作用6
2.2.2大黄酸及其Cu、Al配合物的抗炎作用7
2.2.3大黄酸及其Cu、Al配合物的抗癌作用7
3.大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌机理研究8
第二章实验部分9
2.1实验材料9
2.1.1培养基的基本组成9
2.1.2PBS缓冲液配方10
2.1.3大黄酸本体及其Cu、Al金属配合物溶液的配制10
2.1.4实验仪器11
2.1.5实验试剂12
2.2实验方法12
2.2.1牛肉膏蛋白胨琼脂平板的制备12
2.2.2菌种的活化13
2.2.3供试菌悬液的制备13
2.2.4抑菌谱的测定13
2.2.5MIC和MBC的测定14
2.2.6大黄酸及其Cu、Al金属配合物抑菌稳定性的测定14
第三章结果与讨论16
3.1大黄酸及其Cu、Al金属配合物抑菌活性的试验结果16
3.1.1抑菌谱的确定16
3.1.2大黄酸及其Cu、Al金属配合物的MIC和MBC的确定18
3.2大黄酸及其Cu、Al金属配合物抑菌稳定性的测定20
3.2.1温度对大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌稳定性的影响20
3.2.2pH对大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌稳定性的影响23
3.2.3UV对大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌稳定性的影响25
第四章结论及展望28
4.1结论28
4.2展望28
参考文献：
29
致谢34
大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌活性的研究
学生：
指导老师：
摘要：
目的研究并对比大黄酸Cu、Al金属配合物与本体的抑菌活性。
结果本实验通过牛津杯法抑菌实验，研究了大黄酸及其Cu、Al金属配合物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌四种常见致病菌的抑菌和杀菌方面的生物活性，结果表明大黄酸及其Cu、Al金属配合物对这四种菌都有抑菌活性，其中RH-Al对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强（MIC为15.625μmol/L，MBC为31.25μmol/L），而RH-Cu对于铜绿假单胞菌的抑菌效果最明显（MIC为31.25μmol/L，MBC为62.5μmol/L），通过对比可以看出：
大黄酸Cu、Al金属配合物的抑菌活性明显高于大黄酸本体；同时，本实验还研究了温度、pH、紫外线照射三个因素，结果表明几乎影响不是很大，所以可以忽略外界环境对大黄酸Cu、Al金属配合物抑菌活性的影响，以上实验结果为创制新型抑菌剂提供依据。
关键词：
大黄酸；Cu配合物；Al配合物；抑菌活性；影响因素
StudyonAntimicrobialActivityofRheinandCu,Alcomplexes
Student:
Instructor:
Abstract:
ThepurposeistostudyandcomparethecomplexesofRheinCu,Almetalwiththebody'santibacterialactivity.ThisexperimentaluseoftheOxfordCupantibacterialexperimentsontheRheinandCu,AlmetalcomplexesofE.coli,Bacillussubtilis,PseudomonasaeruginosaandCandidaalbicansfourcommonpathogensbacteriostaticandbactericidalofbiologicalactivity,theresultsshowedthatRheinandCu,Almetalcomplexestothesefourbacteriahaveantibacterialactivit,includingantibacterialactivityRH-AlstrongestBacillussubtilis（MICis15.625μmol/L,MBCis31.25μmol/L）,RH-CuandPseudomonasaeruginosaforthemostsignificantinhibitoryeffect（MICof31.25μmol/,MBCof62.5μmo/L）,Bycontrastcanbeseen:
TheantibacterialactivityofRheinCu,AlmetalcomplexeswasmorehigherthanRheinbody;Meanwhile,theexperimentalsostudiedthetemperature,pH,ultravioletradiationonthreefactors,theresultsshowthattheimpactisnotlarge,soyoucanignoretheimpactofexternalenvironmentontherheinCu,Almetalcomplexesantibacterialactivity,theseresultsprovidethebasisforthecreationofnewantimicrobialagents.
Keywords:
Rhein;Cucomplexes;Alcomplexes;Antibacterialactivity;Influencingfactors
第一章文献综述
前言
目前，常用的各类抗生素在对抗细菌方面往往容易使病原菌产生耐药性,使用在食品卫生等工业方面还易产生残留。
随着公众健康意识的提高,寻求抗生素替代药品的需求愈渐迫切。
从植物中开发天然抑菌剂已成为当前研究的热点［1］，大量研究发现［2-6］多种天然物质如大蒜、芦荟、茶叶等的提取物具有不同程度的抑菌作用，与传统的抑菌剂相比，这类天然抑菌物质来源广泛，加工低廉,在生长过程中不断的与细菌抗争,因此不会产生耐药性,而且几乎无毒副作用,不会产生残留［7］。
国内外对于中草药中抑菌成份的提取、筛选、抑菌性能和抑菌机理进行了大量试验研究［8-9］。
D.Srinivasan［10］等对印度的50种药用植物的水提物的抑菌状况进行研究，发现其中36种植物具有抗菌活性，进一步对这些植物的抑菌谱进行实验，发现其中的12种如姜黄、灰杨柳、柚木等具有广谱的抑菌作用。
赵芳［11］等对大黄酸金属配合物的抗氧化活性状况进行研究，在此利用天然有机活性成分大黄酸首次合成了大黄酸金属配合物，研究了其抗氧化活性，以其有机活性成分和微量元素形成的配合物在动植物体和人体的生命活动中发挥着重要作用。
所以从今后的长远发展来看，大黄等中药材作为抑菌剂的开发，将是一个前景诱人的发展方向，具有较强的抑菌活性，因此很有进一步研究的价值和意义。
1.大黄
1.1大黄的种类和分布
大黄多生于高山林缘或草坡半阴湿处，是我国传统中药材之一,在我国传统医学中应用已久，始载于我国现存最早的药学专著《神农本草经》，因其植株大,根切片色黄，故名大黄。
大黄在我国有39个品种和两个变种，药典正品大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄（RheumpalmatumL.）、唐代特大黄（RheumtanguticumMaxim.eXBalf）或药用大黄（RheumofficinaleBail1.）的干燥根及根茎［12］。
生用，或酒制，蒸熟，炒黑用。
《本草纲目》记载，大黄性寒味苦，归脾、胃、大肠、心包经［13］。
具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效，外敷清火解毒消肿［14］。
用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌打损伤，外治水火烫伤［15］。
1.2大黄的化学成分
据研究，现已从大黄中分离得到蒽醌、二蒽酮、芪、苯丁酮、单宁、萘色酮等不同种类的80多种化合物，大体上分为蒽醌类、多糖类、鞣质类。
蒽醌类含量为3%-5%，分为游离型与结合型。
游离型有大黄酸（英文全称rhein,简称RH）、大黄素（emodin）、土大黄素（chrysaron）、芦荟大黄素（aloe-emodin）、大黄素甲醚（physcion）、异大黄素（isoemodin）、大黄酚（chysophanol）、虫漆酸D（laccaicacidD）等［16］。
结合型主要包括蒽醌苷和双蒽醌酮苷。
双蒽醌酮苷中有番泻苷A，B，C，D，E，F［17］。
其中大黄酸作为结构确知的化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等
多种药理活性。
1.3大黄酸的来源及性质
大黄酸（Rhein）来源于蓼科植物掌叶大黄的根茎、何首乌（lygonummuhiflorumThunb）的根、豆科植物狭叶番泻（Cas-siaangustifoliaVah1）的荚、芸香科植物芸香的全草等。
1844年，Schossberger等首次从大黄中提取纯化出大黄酸，其分子式为C15H8O6，分子量为284.21，黄色针状结晶，熔点321-322℃，330℃分解，几乎不溶于水，可溶于碱性水溶液和吡啶，结构如下。
近年来大黄酸从植物中分离纯化的技术在不断提高［18］，其全合成或半合成的研究也取得了一定的成果［19-20］。
图1-1大黄中部分蒽醌类化合物及衍生物［21］
1.4大黄酸及其Cu、Al配合物的结构特征
大黄酸具有1,8位羟基和9位羰基、完整的大π键共轭体系、强配位氧原子及合适的空间构型，可作为良好的金属离子螯合配体。
根据中药配位化学原理，中药有机成分与微量元素结合后往往会提高其生物活性或产生新的生物活性［22-23］。
铜、铝是一种人体必需的微量元素，是机体内蛋白质和酶的重要组成部分，在人体新陈代谢过程中起着重要的作用。
目前针对中药有效成分的金属配合物研究多集中在黄酮类化合物，如槲皮素、芦丁、黄芩甙和桑色素等，鲜见有关大黄酸类配合物的研究报道。
赵芳等人合成了大黄酸铜（Rhein-Cu或者RH-Cu）配合物，如下图（大黄酸铝配合物基本一样）。
图1-2大黄酸铜配合物的结构式
2.大黄酸及其Cu、Al配合物的研究与应用
2.1大黄酸及其Cu、Al配合物在抑菌领域的研究与应用
大黄中主要的抗菌成分为：
羟基芦荟大黄素、3一羧基大黄酸、羟基大黄素，其中以芦荟大黄素最强。
杨中铎等［24］报道，大黄素和芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌209p、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌及流感杆菌均有抑菌作用。
诱导耐药实验后芦荟大黄素产生耐药性，但大黄素不产生。
抗菌机制是大黄素、大黄酸、芦荟大黄素等蒽醌类物质抑制细菌细胞线粒体呼吸电子传递，影响组织细胞生命活动所需能源的供应。
同时生物活性很低的大黄酚、大黄素甲醚在体内可转化为大黄素、大黄酸发挥药理作用。
M.A.Gouda等［25］用体外试管实验对合成含有吡唑的蒽醌类衍生物进行抗菌活性研究。
氨基蒽醌中的蒽醌部分使其在合成和药物化学方面的生物活性受到了越来越多的关注。
实验表明以蒽醌为基础用2-氰基-N-（9,10-双氧-9,10-双氢-蒽-2-基）乙酰胺合成的含有2-氨基-9,10-蒽醌部分的14种吡唑衍生物对金黄色葡萄球菌，交链孢霉，腐皮镰刀菌，铜绿假单胞菌都有很好的抗菌作用。
MohamedElAmineDib等［26］对杨梅根部三酚醛树脂部分所含的成分筛选后表明存在醌类，蒽醌类，花青素，鞣酸类和黄酮类化合物的结构，并采用水和甲醇分别进行提取分离，实验结果显示经过水提取分离的化合物对大肠杆菌有很好抑制作用，而醇提取分离的化合物对金黄色葡萄球菌抑菌效果一般。
JeanRobertguemeving等［27］从藤黄科根部分离出蒽醌化合物中氧化蒽酮的两个衍生物和11个已知的化合物，并采用光谱法来确定这些化合物的结构。
对20种菌株的抗菌实验和MIC实验表明这两个衍生物对5种革兰氏阴性菌和5种革兰氏阳性菌以及2种酵母菌有抑菌效果。
NawongBoonnak等［28］对黄牛木属进行研究发现其根和皮中存在蒽醌类物质即氧杂蒽酮，经过x射线衍射数据与光谱法确定了其结构。
研究表明这些物质对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较好，对链球菌，伤寒杆菌，铜绿假单胞菌等效果较差。
同时SompongBoonsri等［29］也对黄牛木属根部存在的3种已知蒽醌化合物的抗菌特性进行了具体评价。
实验表明已知蒽醌化合对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，链球菌，伤寒杆菌，抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌效果较差。
JianjunZhang等［30］报道了一类新型结构的阳离子抗菌蒽醌类似物，抗菌实验对金黄色葡萄球，大肠杆菌，肺炎杆菌和分枝杆菌效果较好，对铜绿假单胞菌，肠球菌效果较差。
其中在化合物结构中R—基团上如果是—CH2（CH2）6CH3的蒽醌类化合物则可以明显的选择性作用于革兰氏阳性（G+）病原体包括耐甲氧西林金葡萄球菌（MRSA），而对革兰氏阴性（G-）的细菌作用一般。
霍丽云等［31］报道，芦荟活性成分中蒽醌类化合物主要是羟基蒽醌类衍生物，包括芦荟大黄素苷（又称芦荟苷或芦荟素）、芦荟大黄酚、蒽酚、芦荟大黄素等20余种。
蒽醌类化合物是主要的抗菌物质,还有消炎解毒和愈合伤口等作用，且有一定的广谱性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌及福氏痢疾杆菌都有一定的抑制作用。
其杀菌作用和抗生素的功能相同，但对比抗生素而言，更胜一筹的是其不会产生细菌的耐药性，并且能有效的清除细菌感染时释放出的有害的代谢物和细菌在被杀死后菌体所留下的内毒素。
谢宗波等［32］实验确定了芦荟中蒽醌类化合物对供试菌株的抑菌能力，由强到弱依次为：
木霉—大肠杆菌和米曲霉—金黄色葡萄球菌和产朊假丝酵母—酿酒酵母。
王俊杰等［33］对芦荟中蒽醌类化合物药用价值研究时探讨了糖基取代结构对芦荟苷抗菌活性的影响，在考查了芦荟的抗菌作用和蒽醌类化合物的关系后，得出了芦荟苷的抗菌活性明显强于芦荟大黄素的结论，为主要抗菌有效成分之一，糖基配体的存在可以显著地提高其抗菌活性。
同时田兵等［34］采用琼脂扩散法来分析皂质芦荟叶皮的提取物、芦荟苷和芦荟大黄素对2种革兰氏阳性菌与3种革兰氏阴性菌的抑菌活性。
并用扫描电镜技术进一步证实了芦荟苷具有能够破坏菌体结构与改变菌体形态的功能。
可以通过对蒽醌类化合物与芦荟苷的测定来作检测芦荟抗菌制品的指标，对芦荟制品的质量进行有利于的控制。
陈秋东等［35］研究表明，大黄酚—9—蒽酮对红色发癣菌、犬小孢子菌等真菌有抑制作用。
决明子水浸剂（1:
4）和醇提物能有效抑制许兰氏黄癣菌、奥杜氏小芽孢毛癣、膏样毛癣菌等皮肤性的真菌，醇提物在除醇后，对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、桔色葡萄球菌、乙型副伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大杨杆菌等有抑制作用，然而水浸剂则无此作用效果。
KarrenD.Beattie等［36］评价了在总大黄素成分中大黄素和大黄素甲醚以及其它蒽醌成分的抗菌活性，结果表明亲脂性部分比亲水性部分活跃。
5,7,9,10-四羟基-2-甲氧基-7-甲基-5,6,7,8-四氢化基-1,4-蒽醌、决明蒽酮、大黄素和大黄素甲醚能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长,而且大黄素和大黄素甲醚对铜绿假单胞菌也有效。
大黄酸类化合物为植物抗菌素，对G-和G+菌均有抑制作用［37-39］。
大黄酸对金黄色葡萄球菌、链球菌、淋球菌、白喉、枯草、痢疾、炭疽、伤寒副伤寒杆菌等具有显著抑制作用，且对金黄色葡萄球菌不产生耐药性。
近来报道［40］，大黄酸对新型隐球菌、白色念珠菌等真菌有抑制作用，其最低抑菌浓度为25一250ug/mL。
还有学者发现RH对幽门螺杆菌（Hp）亦有抑制
作用［41］。
2.2大黄酸及其Cu、Al配合物在医药上的应用
2.2.1大黄酸及其Cu、Al配合物的降糖降脂作用
改善糖尿病人脂肪组织胰岛素敏感性的研究也是大黄酸近期研究较为新的热点，降糖活性大黄酸强于大黄素。
大黄酸的降糖机制己成为研究热点,迟锨等［42］发现大黄酸可以上调糖尿病大鼠脂肪组织PPARZγ及GluT24蛋白表达从而促进脂肪组织对葡萄糖的摄取。
邹世沽等［43］发现大黄酸能显著下调糖尿病大鼠肾小管上皮细胞a2SMA、Vimentin表达，阻抑肾小管上皮细胞的表型转化。
谭正怀等［44］发现大黄酸能防治糖尿病肾病，一方面通过抑制TGFβ1和p38MAPK的活性，使FN的生成、分泌减少，另一方面，由于TGFβ1与p38MAPK对MMP22和MMP29的作用相反，大黄酸既抑制TGFβI活性，又抑制p38MAPK的活性，因而对MMPs的活性影响甚小，由于肾小球系膜细胞外基质的生成逐渐减少，而其消化的量逐渐增加，其结果是肾小球系膜细胞外基质的堆积逐渐减轻。
近期研究发现大黄酸具有较好的降脂作用，能够诱导小鼠和人的脂质细胞凋亡，抑制其增殖，从而达到减肥的目的。
袁小青等［45］则发现大黄酸对脂肪细胞分化的抑制作用亦呈剂量依赖性，使得大黄酸具有治疗肥胖相关代谢性疾病的美好前景。
2.2.2大黄酸及其Cu、Al配合物的抗炎作用
大黄酸具有显著的抗炎作用，而不抑制前列腺素的合成,使得其前体药物双乙酞大黄酸（双醋瑞因，Diacerein），作为治疗骨关节炎的药物,已经在意大利上市。
它在人体内能被迅速代谢成大黄酸而发挥治疗OA作用。
解志钢等［46］研究了双醋瑞因治疗不能耐受非路体抗炎药骨关节炎患者的疗效，发现对于不能耐受NSAIDs药物不良反应的OA患者，双醋瑞因安全有效。
药理研究表明，大黄酸可以抑制细胞因子基因的表达［47］，以治疗骨关节炎。
大黄酸可作为抗炎剂治疗或预防与TZ细胞增殖有关或由促炎细胞因子（IL-I和TNF-α）介导的疾病如骨关节炎、糖尿病肾病、多发性硬化、哮喘、炎性肠病、肾小球性肾炎等。
2.2.3大黄酸及其Cu、Al配合物的抗癌作用
抗癌活性及其抗癌作用机制也是目前大黄酸研究的一个热点。
关于大黄酸及大黄酸类衍生物的抗癌研究主要是集中在其抗癌机制上［48-55］，大环葱醒类化合物的三环结构由于其结构模板形式，使得其易于细胞DNA结合，抑制细胞增殖，调节癌细胞中的Ca2+浓度，从而达到抗癌作用。
除此之外根据目前的研究报道［56］，大黄酸中的轻基与超氧阴离子发生单电子转移反应，阻断了邻苯三酚自氧化的自由基链反应，从而具有抗过氧化作用。
而刘彦珠等［57］研究还表明大黄酸在抗动脉粥样硬化方面具有抑制作用。
在吲哚美辛、盐酸以及酒精诱导胃溃疡模型中，大黄酸可通过抑制中性粒细胞释放的活性氧产生抗溃疡作用［58］。
大黄酸尚有抗病毒作用［59］。
3.大黄酸及其Cu、Al配合物抑菌机理研究［60］
（1）大黄酸是线粒体呼吸链电子传递的抑制剂，对NADH脱氢酶有不同程度的抑制作用，对琥珀酸脱氢酶有轻微的抑制作用，对辅酶Q-细胞色素C还原酶及细胞色素C氧化酶也仅有轻微的抑制作用，对NADH脱氢酶的抑制作用力竞争性的。
（2）大黄酸对金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质合成有很强的抑制作用，并有平行关系。
叶酸能拮抗大黄酸对金黄色葡萄球菌核酸合成的抑制作用，机理为大黄酸可通过影响叶酸的酶系统而抑制核酸的合成，进而妨碍蛋白质的形成，影响细菌的生长。
第二章实验部分
2.1实验材料
2.1.1培养基的基本组成
表2-1牛肉膏蛋白胨固体培养基基本组成（液体不加琼脂粉）
成分
含量（g/L）
牛肉膏
3g
蛋白胨
10g
NaCl
5g
琼脂粉
15g
蒸馏水
1（L）
∗注：
用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.2-7.4。
表2-2LB培养基基本组成（液体不加琼脂粉）
成分
含量（g/L）
酵母膏
5g
蛋白胨
10g
NaCl
5g
琼脂粉
15g
蒸馏水
1L
∗注：
用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4-7.6。
表2-3YPD培养基基本组成（液体不加琼脂粉）
成分
含量（mg/L）
酵母膏
10g
蛋白胨
20g
琼脂粉
20g
蒸馏水
900mL
∗注：
无需调节pH。
2.1.2PBS缓冲液配方
母液的配制：
0.03MNa2HPO4：
称取10.74gNa2HPO4-12H2O，溶于100mL水
0.03MNaH2PO4：
称取4.68gNaH2PO4-12H2O，溶于100mL水
（不同pH值得0.03MPB的配方按如下比例移取后，再稀释至1L）
表2-4不同PH缓冲液的配方
Ph
0.3MNa2HPO4（mL）
0.3MNaH2PO4（mL）
5.8
8.0
92.0
6.0
12.3
87.7
6.5
31.5
68.5
7.0
61.0
39.0
7.4
81.0
19.0
7.5
84.0
16.0
8.0
94.7
5.3
2.1.3大黄酸本体及其Cu、Al金属配合物溶液的配制
配制大黄酸本体及其Cu、Al金属配合物溶液，称取下表中质量的不同金属配合物粉末，分别加入20μL的纯DMSO搅拌使之完全溶解，溶液变得清澈透明时，再加无菌水定容至10mL。
表2-52×10-3mol/L浓度的大黄酸及其Cu、Al金属配合物溶液的配制
成分
含量
大黄酸（RH）
0.0057g
RH—Al
0.0140g
RH—Cu
0.0133g
无菌水
10mL
2.1.4实验仪器
表2-6实验中使用仪器
仪器名称
型号
生产厂家
微波炉
G70D23AP-TD（W0）
广东格兰仕微波炉电器制造有限公司
全自动高压灭菌锅
MLS-3750
日本平山制作所
酸度计
PHS-3C
上海仪托环保有限责任公司
冷冻离心机
Centrifuge5810R
德国Eppendoff公司
超净工作台
JJ2011-03-101
苏州市金净净化设备科技有限公司
恒温水浴
TB-85
江苏海门其林医药设备厂
家用冷藏冷冻箱
BCD-210GM
青岛海尔股份有限公司
超声波清洗器
KQ5200B
昆山市超声仪器有限公司
电热恒温培养箱
DHP-360
北京市永光明医疗仪器厂
电子天平（1/100）
BL150
北京赛多利斯仪器设备公司
电光天平（1/万）
BS224S
北京赛多利斯仪器设备公司
移液枪
100-1000μL
杭州陆恒生物科技有限公司
恒温培养振荡器
NSKY-10013
上海苏坤实业有限公司
牛津杯
0.6×7.8×10mm
东台市吉泰不锈钢制品厂
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