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总大肠菌群.docx

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总大肠菌群

2总大肠菌群

2.1多管发酵法

2.1.1范围

本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。

2.1.2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1.2.1

总大肠菌群totalculiforms

总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2.1.3培养基与试剂

2.1.3.1乳糖蛋白胨培养液

2.1.3.1.1成分

A蛋白胨10g

B牛肉膏3g

C乳糖5g

D氯化钠5g

E溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L）1mL

F蒸馏水1000mL

2.1.3.1.2制法

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2～7.4，再加入1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

2.1.3.2二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

按上述乳糖蛋白胨培养液（2.1.3.1），除蒸馏水外，其他成分量加倍。

2.1.3.3伊红美蓝培养基

2.1.3.3.1成分

A蛋白胨10g

B乳糖10g

C磷酸氢二钾2g

D琼脂20g~30g

E蒸馏水l000mL

F伊红水溶液（20g/L）20mL

G美蓝水溶液（5g/L）13mL

2.1.3.3.2制法

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，以68.95kPa（115℃，10lb）高压灭菌20min。

临用时加热融化琼脂，冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。

2.1.3.4革兰氏染色液

2.1.3.4.1结晶紫染色液

A成分：

a结晶紫1g

b乙醇（95%，体积分数）20mL

c草酸铵水溶液（10g/L）80mL

B制法：

将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

注：

结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。

结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

2.1.3.4.2革兰氏碘液

A成分：

a碘1g

b碘化钾2g

c蒸馏水300mL

B制法：

将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。

2.1.3.4.3脱色剂

乙醇（95%，体积分数）。

2.1.3.4.4沙黄复染液

A成分：

a沙黄0.25g

b乙醇（95%，体积分数）10mL

c蒸馏水90mL

B制法：

将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。

2.1.3.4.5染色法

A将培养18h~24h的培养物涂片。

B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗。

E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。

2.1.4仪器

2.1.4.1培养箱：

36℃士1℃。

2.1.4.2冰箱：

0℃～4℃。

2.1.4.3天平。

2.1.4.4显微镜。

2.1.4.5平皿：

直径为9cm。

2.1.4.6试管。

2.1.4.7分度吸管：

1mL，10mL。

2.1.4.8锥形瓶。

2.1.4.9小倒管。

2.1.4.10载玻片。

2.1.5检验步骤

2.1.5.1乳糖发酵试验

2.1.5.1.1取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取lmL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。

对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。

2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.0lmL甚至0.1，0.01，0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。

接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种．每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。

2.1.5.1.3将接种管置36℃士l℃培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。

2.1.5.2分离培养

将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃土1℃培养箱内培养18h~24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。

深紫黑色、具有金属光泽的菌落；

紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；

淡紫红色、中心较深的菌落。

2.1.5.3证实试验

经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。

2.1.6结果报告

根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（mostProbablenumber，最可能数）检索表，报告每l00mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。

5管法结果见表2，15管法结果见表3。

稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。

如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。

表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）

5个10mL管中阳性管数

最可能数（MPN）

<2.2

2.2

5.1

9.2

16.0

>16

表3总大肠菌群MPN检索表

（总接种量55.5mL，其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样）

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

0.1

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

0.1

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

接种量/mL

总大肠菌群/（MPN/100mL）

0.1

110

130

120

150

180

110

140

180

210

250

130

170

220

280

350

430

240

350

540

920

1600

>1600

2.2滤膜法

2.2.1范围

本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。

2.2.2术语和定义

下列术语及定义适用于本标准。

2.2.2.1

总大肠菌群滤膜法membranefiltertechniquefortotalcoliforms

总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。

2.2.3培养基与试剂

2.2.3.1品红亚硫酸钠培养基

2.2.3.1.1成分

A蛋白胨10g

B酵母浸膏5g

C牛肉膏5g

D乳糖10g

E琼脂15~20g

F硫酸氢二钾3.5g

G无水亚硫酸钠5g

H碱性品红乙醇溶液（50g/L）20mL

I蒸馏水1000mL

2.2.3.1.2储存培养基的制备

先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，68.95kPa（115℃,10lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。

本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL~3mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。

2.2.3.1.3平皿培养基的配制

将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。

待冷却凝固后置冰箱内备用。

此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。

如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。

2.2.3.2乳糖蛋白胨培养液

同2.1.3.1。

2.2.4仪器

2.2.4.1滤器。

2.2.4.2滤膜，孔径0.45μm。

2.2.4.3抽滤设备。

2.2.4.4无齿镊子。

2.2.4.5其他仪器同多管发酵法2.1.4。

2.2.5检验步骤

2.2.5.1准备工作

2.2.5.1.1滤膜灭菌：

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。

前两次煮沸后需更换水洗涤2次~3次，以除去残留溶剂。

2.2.5.1.2滤器灭菌：

用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

也可用蒸汽灭菌器103.43kPa（121℃，15lb）高压灭菌20min。

2.2.5.2过滤水样

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×104Pa（负0.5大气压）下抽滤。

2.2.5.3培养

水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24±2h。

2.2.6结果观察与报告

2.2.6.1挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色，具有金属光泽的菌落；

深红色，不带或略带金属光泽的菌落；

淡红色，中心色较深的菌落。

2.2.6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。

2.2.6.1.2按式

（1）计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL水样中的总大肠菌群数（CFU/100mL）报告之。

2.3酶底物法

2.3.1范围

本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检测。

本法可在24h判断水样中是否含有总大肠菌群及含有的总大肠菌群的最可能数（MPN）。

本法可同时检测大肠埃希氏菌。

见大肠埃希氏菌检测（4.3）。

2.3.2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.3.2.1

总大肠菌群酶底物法enzymesubstratetechniquefortotalcoliforms

总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galanctosidase）的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。

2.3.3培养基与试剂

2.3.3.1培养基

在本标准中酶底物法采用固定底物技术（DefinedSubstrateTechnology，DST），本方法采用Mini-malMediumONPG-MUG（MMO-MUG）培养基，可选用市售商品化制品。

每1000mLMMO-MUG培养基所含基本成分为：

A硫酸铵[（NH4）2SO4]5.0g

B硫酸锰（MnSO4）0.5mg

C.硫酸锌（ZnSO4）0.5mg

D硫酸镁（MgSO4）100mg

E氯化钠（NaCl）10g

F氯化钙（CaCl2）50mg

G亚硫酸钠（NaSO3）40mg

H两性霉素（AmphotericinB）1mg

I1-邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）500mg

J4一甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）75mg

K茄属植物萃取物（Solanium萃取物）500mg

LN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES钠盐）5.3g

MN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）6.9g

2.3.3.2生理盐水

8.5g/L的生理盐水，用于稀释样品。

成分：

氯化钠8.5g

蒸馏水加至1000mL

溶解后，分装到稀释瓶内，每瓶90mL，103.43kPa（121℃,151b）20min高压灭菌。

2.3.4仪器设备

2.3.4.1量筒：

l00mL、500mL、1000mL。

2.3.4.2吸管：

1mL、5mL及10mL的无菌玻璃吸管或塑料一次性吸管。

2.3.4.3稀释瓶：

100mL，250mL，500mL,及1000mL能耐高压的灭菌玻璃瓶。

2.3.4.4试管：

可高压灭菌的玻璃或塑料试管，大小约15mm×10cm。

2.3.4.5培养箱：

36℃士1℃。

2.3.4.6高压蒸汽灭菌器。

2.3.4.7干热灭菌器（烤箱）。

2.3.4.8定量盘：

定量培养用无菌塑料盘，含51个孔穴，每一孔穴可容纳2mL水样。

2.3.4.9程控定量封口机：

用于51孔或97孔法（MPN法，最可能数法）定量盘的封口。

2.3.5检验步骤

2.3.5.1水样稀释

检测所需水样为100mL。

若水样污染严重，可对水样进行稀释。

取10mL水样加入到90mL灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。

2.3.5.2定性反应

用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入2.7g士0.5gMMO-MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解后，放入36℃士1℃的培养箱内培养24h。

2.3.5.310管法

2.3.5.3.1用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样，，加入2.7g士0.5gMMO-MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。

2.3.5.3.2准备10支15mm×10cm或适当大小的灭菌试管，用无菌吸管分别从前述稀释瓶中吸取10mL水样至各试管中，放入360℃±1℃的培养箱中培养24h。

2.3.5.451孔定量盘法

2.3.5.4.1用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入2.7g士0.5gMMO-MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。

2.3.5.4.2将前述100mL水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。

放入36℃士1℃的培养箱中培养24h。

2.3.6结果报告

2.3.6.1结果判读

将水样培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。

2.3.6.2定性反应

水样经24h培养之后如果颜色变为黄色，判断为阳性反应，表示水中含有总大肠菌群。

水样颜色未发生变化，判断为阴性反应。

定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告。

2.3.6.310管法

2.3.6.3.1将培养24h之后的试管取出观察，如果试管内水样变成黄色则表示该试管含有总大肠菌群。

2.3.6.3.2计算有黄色反应的试管数，对照表4查出其代表的总大肠菌群最可能数（MPN）。

结果以MPN/100mL表示。

如果所有管未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。

表410管法不同阳性结果的最有可能数（MPN）及95%可信范围

阳性试管数

总大肠菌群

（MPN/100mL）

95%可信范围

下限

上限

＜1.1

3.0

1.1

0.03

5.9

2.2

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