nacb肿瘤标志物质量标准.docx
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nacb肿瘤标志物质量标准
国家临床生物化学协会对查验医学中肿瘤标志物临床实践应用的操作指南：
质量标准
背景：
本文是最新版本的国家临床生物化学协会对查验医学中肿瘤标志物临床应用的质量标准操作指南的精编本。
方式：
一个小组负责制定关于当前临床实践中血清和组织中肿瘤标志物分析质量的指南。
另外两个小组那么起草关于进一步进展微阵列（矩阵）检测及质谱分子技术的针对性建议。
结果：
在日常实践中合理利用肿瘤标志物的前提条件包括：
正确的临床疑心的形成以确信选择最为适合的检测项目，尽最大可能接近最好的临床和实验操作表现（例如将病人或标本、标本管类型和抽样时刻显现错误的风险降至最低），利用采纳国际标准化及特性完善的方式，认真研究制造商关于方式学及临床相关意义的说明及源于室内质控和重复性周密实验的活化前和即是反映信息。
精心设计的操作规程包括为减少因受嗜异性抗体或钩状效应阻碍而报告错误结果的尽力；使信息化报告标准加倍便利（例如，累加和/或图形化报告，适当细化参考区间并进行说明性评估）；而且在适那时候将此报告信息与病人的其他信息整合与电子病历中。
咱们也被要求关于包括以后可能应用于临床实验室的新技术例如微阵列（矩阵）分析和质谱在内的所有级别的分析技术进行研究。
通过与包括研究者、诊断产品制造商、临床和实验室利用者及相关治理机构在内的沟通，使得用于高质量肿瘤标志物的相关标准变得简练起来。
结论：
这些建议的提出和发表关于临床实践有所裨益也将会使肿瘤标志物的临床利用最优化。
正文：
本文咱们介绍美国国家临床生物化学协会对用于肿瘤标志物的要紧实验室检测、用于肿瘤诊断的微阵列（矩阵）检测及用于提供病人血清及肿瘤组织信息的MALID及相关质谱技术所提出的建议和指导。
本文是NACB完全版本的浓缩文本，因为本刊篇幅有限不能将全文在此全数刊登。
本文增刊的电子版本另增加有图表等更多相关信息，而且原文也能够在网路版中取得。
关于在指南中为何利用这几种检测方式的相关说明将随后提供（目前尚未出版）。
依照NACB所要求的作者（合作者）列表及利益冲突声明均已发表在网络增刊数据库的表格中。
另外利益冲突声明亦发表在原文正文后。
所有已收到关于此建议的评论都在网络版本上有所记录还有咱们对此做出的答复。
这些建议（指南）的前期预备包括对肿瘤标志物应用相关文献的回忆。
关于综述性质文献咱们给予了专门关注，其中有一些相关的系统回忆性综述及专家组发表的共识指南等。
NACB专家组的一致性建议将尽可能成立在已知的相关证据支持基础上，也确实是说该建议是寻证性的。
NACB对肿瘤标志物应用的质量标准
本次质量标准进一步完善了NACB和EGTM的原建议且为常规临床实验室最常常检测的肿瘤标志物，其临床应用相关的质量标准如下题目所述：
●分析前标准：
肿瘤标志物的选择；标本类型；采样时刻；标本运输
●分析中标准：
检测标准化；室内及室间质控；干扰因素
●分析后标准：
参考范围；肿瘤标志物结果的说明与报告
本次建议也简要表述了一些关于当前及以后增强肿瘤标志物临床有效性的问题。
分析前质量标准：
相较其他实验结果的错误报告，肿瘤标志物结果的错误报告似乎更能引发病人没必要要的忧虑。
通过进一步增强常规分析前标准在所有诊断检测的应用及鼓舞更适宜踊跃的检测要求，实验室应付出更多的尽力和警戒以确保结果的正确报告。
就像一篇综述中所提到的，错误报告更多发生于分析前而非分析中[别离为30%-75%对13%-31%，在输血医学中乃至高达10倍以上]。
肿瘤标志物分析前错误要紧为低级的标本输送错误等例如采样时刻不对、标本混淆或标本数据错误。
这在优秀实验室能够通过操作和有效地确认审核机制以最小化。
有一些另外的情形会造成误导性结果。
NACB肿瘤标志物的指导提出：
通过正确适合的标本采样时刻、必要的鼓舞对确信标本所提出的要求尤其是阻止不正确的实验要求，能有助于减少致使病人蒙受没必要要压力或经受没必要要医学检查的风险。
随着电子病历的进展，肿瘤标志物医嘱的产生进程应与以数据为基础的分析前提示相关联以便为更好的临床决策提供支持。
这种数据库目前有AACC的网络数据库等（AACC美国临床化学协会）。
分析中质量标准：
随着自动免疫检测分析仪的应用范围不断扩大，分析中质量的责任已大部份需依托诊断产品供给商。
而这些供给商那么需要依照有国际或国家相关治理组织制定的质量标准执行。
对任何正确的分析检测而言，实验室能够独立监测其自身的实验表现以确信分析仪是不是正常利用而所利用的方式依照介绍说明也应被确信，以上这点相当重要。
上述进程通过严格的室内质控及参与精心升级的重复性实验能够最终实现。
实验室不仅参与上述实验进程更应在补救性活动中表现良好，这一点也很关键，即能当即发觉异样结果的产生缘故。
NACB关于室内质控（ICQ）及周密重复性实验（PT）的建议发表在增刊网络版的第三表格中。
尽管这些建议中绝大多数可用于所有检测仪器，但也有一些是专门与肿瘤标志物相关的。
ICQ和PT所需标本应当与临床血清相类似，如此才能保证其靠得住性。
但医学决定水平被确认后，稳固而持久的实验表现确实是必需的，同时质控的样本浓度也应当与医学决定水平相近似。
如此的建议对用于无病症人群的筛查实验相当重要。
例如检测前列腺特异性抗原先筛查前列腺癌或关于化学医治会部份造成肿瘤标志物升高而无其他检测能够利用的病例和对睾丸癌病人的监测。
功能灵敏性（例如，极低值能够靠得住报告，被概念为日间浓度变异系数（CV）<20%）在某些肿瘤的应用也很重要，例如前列腺部份切除后病人的PSA监测。
通过对同一低值浓度标本的重复检测，重复性实验能对随时刻转变的结果稳固性提供有价值的信息。
由于肿瘤标志物常常长期用于肿瘤病人的监测，在其他分析浓度长期检测稳固性的评判也应建议进行。
长期监测的要紧挑战（或问题），因为病人可能会改换就医医院或检测标本的临床实验室，随之改变的是肿瘤标志物的检测方式。
最理想的结果是从各类方式中取得的结果都能够完全转换。
但不幸的是，事实不是如此：
关于某些肿瘤标志物的周密度重复性实验说明其方式间的变异系数超过20%。
这一现象的要紧缘故是多种分析仪器的复杂性及质次的标准品，抗体特异性的不同及方式设计上的不同。
合理的标准化和准确的定标都应达标，但这仅限于那些有国际标准认可或国际参考试剂的分析仪和其方式的一级标准已被制造商经全世界定标改良。
任何要紧的CA系列肿瘤标志物都没有国际标准化，这是一个亟待解决的重要障碍。
若是有一个相对的国标标准品或国际参考试剂，恢复PT的相关实验再结合线性及稳固性研究就能够为PT提供一个作为基础的独立合理的一致性靶值。
通常，由于PT提供者需要为提高方式间一致性而尽力，因此这些实验也能够被看做是对单个方式定标准确性的评估，以帮忙区分那些需要提高的方式（例如，超过或低于相对国际标准品10%的方式）。
长期PT数据也能够确信一个新国际标准品成功引入后的成效。
一个来自PT的数据显示，在第一个PSA国际参考试剂采纳前的1995年方式间平均CV为%而2004年其应用后平均CV减少到%.
用于人类绒毛膜促性腺激素（HCG）异构体和PSA的国际参考试剂（在IFCC赞助下研发）为说明方式间不同的第二个要紧缘故（抗体特异性）提供了一个工具.应用针对PSA和游离Psa的国际参考试剂并精心设计的实验能够评估对PSA的等分子数检测及定标,这关于前列腺癌的筛查领域尤其重要.与之相似,用六种已成立的国际参考试剂进行的对HCG异构体的检测能够说明在实际检测中所检测的究竟是那种亚群.它关于广谱HCG相关分子识别建议在肿瘤学中的应用是一个很重要的问题.抗原表位绘制打算在国际肿瘤学及生物标志物协会的赞助下进行可能会形成一个普遍的关于某些肿瘤最具临床抗体特异性的建议.就如已完成的HCG一样.
这些研究将致使关于设计针对复杂肿瘤标志物最理想方式更好的明白得并从而解决造成方式学不同的第三个缘故.所设计方式的不同似乎会致使所观看结果的显著不同而方式完善性的不同那么归因于临床的相关干扰.关于后者的潜在危险维持时刻警戒是完全必要的.事实上,将未熟悉到的干扰所致使的严峻临床错误减至最少的最有效方式即是推动实验室人员与临床的常常性交流并鼓舞初期讨论并炎症任何不符合临床状况的结果.
分析后质量标准:
依照增刊网络数据库第六表格NACB建议关于帮忙性报告预备的规定,它鼓舞实验室与临床之间的沟通,这是一个精心设计的部份以使肿瘤标志物的利用达到最正确状态.临床实验室应该在肿瘤标志物结果说明中表现的加倍踊跃而且确保有适合的体会证的参考范围提供.综合评估分析变量及生物变异度同时也考虑其他一些相关特殊肿瘤标志物或某些恶心疾病,例如肿瘤标志物的半衰期和动力学.肿瘤标志物结果与其他病人在院所做的检查一路被保留在电子病历中并被作为肿瘤再发时该病人的肿瘤标志物基础水平,如此能够方便快捷的初期诊断疾病的再发.电子病历已经变得更全国或国际一致化,其记录格式文本都更趋一样.
增强肿瘤标志物靠得住性及有效性的临床问题
肿瘤标志物是一个替代性指示物,它能够增加或减少临床医生关于以后可能显现的重要临床事件的疑心,例如肿瘤的发生、再发、进展或病人的死亡可否发生和/或一个针对性医治是不是能够减少此类危险的发生.肿瘤标志物能够用于检测发生风险,筛查初期癌症,确立诊断,评估预后/医治成效和/或监测疾病的再发或进展.肿瘤标志物是很有价值的因为它能够使医治的利用更为有效,使适于某种医治的病人从该项医治中获益而同时避免另外的医治其毒性作用于不能从中获益的病人.
只有当以下3种情形取得知足肿瘤标志物才是有效的:
●肿瘤标志物仅精准的适用于所要求应用的范围,例如风险评估,筛查,诊断,预后,预测或医治后检测
●肿瘤标志物结果将病人分为两组或更多,其结局不同使医护人员对其中一组进行干与或医治异于另外组.这一考虑基于以下几种因素包括关于最终结局的疑问（病人或许相较能减少肿瘤新发的医治更易于同意哪怕轻微减少现肿瘤死亡的医治）及医治的费用.
●关于将结局区分为标志物阳性和阴性的估量是靠得住的.
这些问题都是彼此关联的例如,某种肿瘤标志物预测价值的研究会选择医治对其有所帮忙的人群以便让临床医生决定应用何种医治.
进一步说,尽管统计分析关于估量肿瘤标志物区分两种不同人群的靠得住性是超级重要的,但单独的P值却没有任何临床有效性.若是一个研究是有效地,那么用阴阳性结果区分的两组间结果的微小不同或许都是有统计学显著性意义的.当P<,对一个调查者来讲得出标志物有临床应用价值的结论再平常只是了.但是,关于临床应用更重要的是当标志物在一个人群为阳性/阴性时在另外一个人群是阴性/阳性,如此一个人群就需要同意对其有利的医治而另外一群那么没必要.在一些研究中,P值显示有统计学显著性不同但在实际临床应用中它却不是决定因子的标尺.总之,一个单独的研究不能成立一个科学事实.更有甚者,在一个结果数据设置中成心义的研究结果的不中断授权和达标是完全必要的且前后研究所用的检测方式/人群和临界值都应一致.在最近完成发表的关于肿瘤标志物预后的研究例如REMARK指南中其对优秀报告的建议里尤其强调这些要求,REMARK指南也补充了之前关于诊断准确性报告标准的大量内容.
——利用样本以达到具有统计学意义的结果即可.这些研究被以为是第三品级证据仅对产生某些假说有效,却不是能够继续进行的有完整研究设计和打算的调查其产生的结果不能作为科学事实.事实上,二级证据研究中标志物被作为一个前瞻性临床实验的次要目标.在一级证据中标志物被作为第一研究目标进行求证,这似乎才更有希望产生有临床用途的结果.换句话说,提问再取得回答比先有答案在去考虑如何提问要好得多.这种寻证性考虑在病人一辈子命濒临危险时尤其重要且要明白肿瘤标志物的适用征.
肿瘤诊断中的微阵列（矩阵）检测
背景:
1980年提出的微量检测原理在1996年第一次由Affymetrix实现其基因微量检测并在以后不断有冲破性进展.简单来讲,Ekins的Ambient分析理论以为在某一平面上数量庞大但很微小的结合物质（例如抗体）尽管不能改变被测物的浓度但却能较常规检测提高灵敏度.利用显微镜式点样器将结合物以高密度形式固定在一个固体支持物表面（通常有极高特异性标记物）,能够产生较常规配体检测方式尤其是非竞争性检测更高的灵敏度和更短的孵育时刻.
尽管仍要紧局限于研究应用,但微阵列（矩阵）分析——生物芯片、DNA芯片、蛋白芯片在肿瘤学中有极大地应用潜力.它能够同时平行的检测复杂系统或途径并对细胞、组织、器官或体液的生物学特性提供一个观看缩影。
关于肿瘤诊断相关的微阵列（矩阵）检测已经有商业化试剂盒和/或已在研发中.
微阵列（矩阵）检测的原理
一个微阵列（矩阵）检测即是一个含有大量精心设计好的固定捕捉分子的密集装置（例如产生的寡链,PCR产物,蛋白或抗体）.最为熟悉的一种微阵列（矩阵）检测——DNA生物芯片即是一种极微量在玻璃或塑料表面捕捉寡核苷酸的检测。
通过微量检测序列与标记探针的杂交，微阵列（矩阵）检测被用于基因活性（表达程度）及辨别基因突变及寡核苷酸多态性。
制作微阵列（矩阵）要紧有两种方式：
以激光照排或机械点样方式于玻璃或生物膜表面。
以微阵列（矩阵）为基础检测的要紧潜在优势为极高的灵敏性，只需要少量结合试剂，任意量的样品，减少孵育时刻，最小化的试剂消耗，可同时检测多种基因或蛋白且能定量。
关于此方面的详细信息请参阅专业书籍及文献。
组织微阵列（矩阵）分析
通过新技术高通量的组织分析已变得加倍便利,类似多组织的NORTH印迹、蛋白阵列（矩阵）及实时PCR.但是组织在分析前需要进行粉碎匀浆，这就阻止了对所关注表达到心义基因的细胞型的辨别。
这一局限性将被组织微阵列（矩阵）所克服。
它由据聚集在常规石蜡包埋组织中的1000个微小椭圆柱体组织样本组成，能高效用比的同时对1000个数字样本进行检测。
微阵列（矩阵）的应用
微阵列（矩阵）已被成功应用与多方面，例如基因表达检测、单核苷酸多态性、杂交测序、蛋白表达检测，蛋白间彼此作用研究及全基因生物学实验。
尽管其潜力还远未被充分熟悉，但作为探讨复杂疾病包括癌症的工具它显示出庞大的可能性。
微阵列（矩阵）的局限性
微阵列（矩阵）激素仍处于不断的进展中，由于没有一个好的标准能够使不同实验室及操作平台的数据结果便利的进行比较因此其标准化很难。
最近的报告显示微阵列（矩阵）的结果不具有可重复性且有偏倚。
关键点：
肿瘤诊断中的微阵列（矩阵）
微阵列（矩阵）无疑将会变成常规的诊断工具，但如期望的第一一些变量必需选定好（例如捕捉分子、杂交记录和数据搜集），成立质量操纵体系，决定适宜的分析水平和临床应用达标。
微阵列（矩阵）所的数据结果的评估应当认真考虑其生物系统结果的准确性及利用范围，并想到所得表述该现象的数据是不是真正源于所调查对象，与此同时要对随时可能显现的假象有所预备。
适用性达标要求有实验室质量操纵、独立的数据确认及结果的通用性。
自动化对减少变异及增加完善性也是完全必要的。
当前许多关于微阵列（矩阵）临床应用的研究其证据品级仅为5级。
唯一的例外是70-基因对乳腺癌结局的估量，这一检测经历了内部及外部的适用性达标2007年由FDA颁发了许可证。
基于以上信息，NACB专家组形成了表1中的简要建议。
肿瘤诊断中的质谱
质谱原理被用于肿瘤诊断的情形汇总如下。
质谱应用于临床实际的建议尤其关于MALID及相关类似用于蛋白组分析的SELID质谱技术亦包括其中。
诊断用质谱的原理：
一个典型的质谱由一个离子源，一个用于检测质量电荷比的质量分析器及一个识别核质比数据的检测器组成。
质谱检测是在将物质离子化的气态下进行的，常常应用电喷离子化器或MALID来加压并离子化蛋白或多肽。
后者的改良型为SELID。
质谱依照物质的质量电荷比分离电离体。
有四种大体型质谱用于蛋白组研究：
离子捕捉、TOF、Quadrupole及傅立叶变换离子回旋加速共振，第五种可能的质谱为新型的ObitrapTM。
这些分析仪能够任意组合。
利用MALID/SELID-TOF质谱发觉生物标志物共有两种方式。
一种方式是利用疾病及操纵对照标本的质谱信号的不同来成立一个诊断模式，这种模式的一种变体是选择一些可分辨的蛋白或多肽的质谱峰值图并辨别其性质，诊断那么依托于多重的免疫质谱或ELISA。
另一中方式是将蛋白酶解为多肽，将这些肽用类似HPLC的技术进行分离；直接将所得分纯片段经离子源完全离子化后送入质谱算法加权处置即取得数据。
蛋白鉴定既能够通过量肽质量指数也能够通过氨基酸测序取得。
在这之前，需鉴定的多肽质谱数据通过适合的软件与数据库中的数据进行比对，多肽测序那么是基于对临近氨基酸残基间肽链随机断裂的诱导，例如撞击诱导的游离且由所取得的电离物检测氨基酸序列。
质谱在肿瘤诊断中的应用
质谱尤其适于被用作肿瘤诊断或发觉生物标志物的工具，因为在肿瘤发生进程中，肿瘤细胞或/和微环境周围产生的不同的蛋白和多肽种类和浓度与正常组织细胞完全不同。
这些非正常组织的散布通过质谱图谱得以分析且与正常对照比较而发觉的肿瘤特异性改变或许是有临床用途的。
肿瘤特异性分析也学还能够检测出泄露入血液中的肿瘤或其蛋白是不是发生于肿瘤原位微环境中。
质谱被用来显示许多绝大多数在血液和尿液中的肿瘤特异性蛋白。
几乎每一篇公布发表的MALID-TOF质谱相关报告都说明这种方式比当前利用的肿瘤标志物产生更好的诊断灵敏性及特异性从而产生更普遍的社会效应。
但是开始的热情随着对此方式的潜在问题及其临床应用靠得住性尤其是严格达标操纵适用范围的重要性的报告而平淡下去。
若是MALID-TOF能够成功完成从研究技术到临床应用的转换，那么与变异相关的所有——分析前、分析中和分析后都必需被详细深刻的明白得并有效操纵；样本贮存及操作的效应，标本类型、病患的选择及人口学变异对检测结果的阻碍都应该被清除的估量；与已成立的免疫检测技术相较，它的分析操作在灵敏性、特异性、反映线性范围上都有所提高。
进一步的研究应关注于通过不同的芯片处置及加工进程、不同分析仪器、不同实验室及不同实验条件蛋白检测模式的可重复性。
固然该方式的完善性也有诸如生物信息假象、数据不符及由实验设计所致的偏倚升高等相关问题。
其中一些问题可能与可公布取得的质谱数据集的利用不妥有关。
最近一组研究者成功的在不同时刻及实验条件下在多实验室取得可重复性的数据。
这一进展给那些试图籍MALID-TOF检测蛋白指纹用于诊断的人以专门大的鼓舞。
当前MALID-TOF的适用范围和局限性专门是当应用于临床检测和肿瘤诊断，在最近出版的几个综述中有更详细的描述（该文献请参考网络原始版本的参考文献）
关键点：
肿瘤诊断中的质谱
尽管大量出版物都描述了关于MALID-TOF质谱的临床诊断应用，但其中大多数都是四至五级证据研究（例如不是回忆性确实是宏观小规模）。
依照已出版该系列的文献，该技术的进展仍处于一期（临床应用前研究）。
NACB共识建议的形成也是基于这一信息。
MALID-TOF质谱方式被以为是可用于生物标志物的发觉及相关范围。
可是在临床应用前咱们所讨论的问题都应该解决。
蛋白组学质谱的优势在于没必要标记进行检测，有较高特异性、多数据参数分析、高通量、样品加样量少且直接进行电脑算法分析。
最重要的局限性为数据产生真实性操作台间变异，对标本运输及处置中微小转变很灵敏，灵敏性较低尤其当分析物为少量含复杂大分子的混合物。
但某些MALID-TOF方式也有其固有的优势。
事实上，MALID-TOF分析结合免疫分离技术能清除抗抗体并检测多重衍生分析物例如蛋白异构体。
另外，令人兴奋的新研究显示许多小分子蛋白及低分子物在血清中存在结合状态且通过携蛋白多价螯合物可有效被放大。
这些低分子量分析物对许多过去的质谱指纹有所支持，这一现象提示许多如此的离子或许是从低丰度分析物中产生。
最近这些低分子量载体蛋白结合分析物的列表已供初期卵巢癌病人利用。
除非有普遍的适用性研究发布，不然MALID-TOF质谱指纹图谱都不能被用于肿瘤诊断。
若是要应用质谱指纹图谱，必需要有包括适当数量的炎症、良性病患和未受阻碍（正常）质控物的独立适用性设置，因为其特异性将关系到临床应用的成败。
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