微生物学实验指导大全Word文件下载.doc
《微生物学实验指导大全Word文件下载.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物学实验指导大全Word文件下载.doc（102页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。
分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。
半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。
棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。
有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。
有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。
然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8．灭菌将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。
9．摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。
10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二）高氏l号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。
可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·
3H2O0.5g，MgSO4·
7H2O0.5g，FeSO4·
7H2O0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
l．称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。
再加入其他成分依次溶解。
对微量成分FeSO4·
7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·
7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。
待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
（三）马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。
K2HPO41g，MgSO4·
7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。
1．称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。
待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。
再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。
3．链霉素的加入链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。
可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL，使每毫升培养基中合链霉素30μg。
四、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
调pH时要小心操作，避免回调。
不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
五、实验报告
记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
六、问题和思考
l．配制培养基有哪几个步骤?
在操作过程中应注意些什么问题?
为什么?
2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?
若不能及时灭菌应如何处理?
已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
3．试设计实验对饮料进行无菌检查。
实验2消毒与灭菌
一、干热灭菌
（一）目的要求
1．了解干热灭菌的原理和应用范围。
2．学习干热灭菌的操作技术。
（二）基本原理
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的电烘箱的结构如图2-1。
图2-1电烘箱的外观和结构
A.外观B.结构
1.温度计;
2.排气阀;
3.箱体;
4.控温器旋钮;
5.箱门;
6.指示灯;
7.加热开关;
8.温度控制阀;
9.控制室;
10.侧门;
11.工作室;
12.保温室;
13.电热器;
14.散热板;
15.搁板
（三）器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱等。
（四）操作步骤
1．装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。
物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
2．升温
接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。
当温度升至100℃时，关闭排气孔。
在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。
3．恒温
当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。
干热火菌过程。
严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
4．降温
切断电源、自然降温。
5．开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。
电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
（五）实验报告
思考题
l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?
2．为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?
请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。
二高压蒸气灭菌
1．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。
2．学习高压蒸气灭菌的操作方法。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。
待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。
其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2—1），二是湿热的穿透力比干热大（表2—2），三是湿热的蒸气有潜热存在。
1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表2—1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵白蛋白含水量/%
30分钟内凝固所需温度/℃
50
56
25
74～80
18
80～90
6
145
160～170
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2—3）
表2-2干热温热穿透力及灭菌效果比较
温度/℃
时间/h
透过布层的温度/℃
灭菌
20层
10层
100层
干热130-140
4
86
72
70.5
不完全
湿热105.3
3
101
完全
表2—3灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数
全部空气排出时的温度/℃
2/3空气排出时的温度/℃
1/2空气排出时的温度/℃
1/3空气排出时的温度/℃
空气全不排出时的温度/℃
Mpa
Kg/cm2
Ib/in2
0.03
0.35
5
108.8
100
94
90
0.07
0.70
10
115.6
109
105
0.10
10.5
15
121.3
115
112
0.14
1.40
20
126.2
121
118
0.17
1.75
130.0
126
124
0.21
2.10
30
134.6
130
128
现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：
1kg/cm2=98066.5Pa；
1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培养基用0.1Mpa（相当于15Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。
又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图2-2，A）和手提式（图2—2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。
图2—2A卧式灭菌锅
图2—2B手提式灭菌锅
1.安全阀;
2.压力表;
3.放气阀;
4.软管;
5.紧固螺栓;
6.灭菌桶;
7.筛架;
8.水
（三）器材
牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。
因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。
否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
l．结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2．思考题
（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?
灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?
（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?
（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?
三、紫外线灭菌
了解紫外线灭菌的原理和方法
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。
波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。
在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。
紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。
另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。
O3和H2O2均有杀菌作用。
紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。
紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。
此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；
可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。
无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。
1．培养基牛肉膏蛋白胨平板。
2．溶液或试剂3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液。
3．仪器或其他用具紫外线灯。
l．单用紫外线照射
（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。
（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。
置37℃培养24h。
共做三套。
（3）检查每个平板上生长的菌落数。
如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
2．化学消毒剂与紫外线照射结合使用
（1）在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。
（2）无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。
（3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”（3）]。
因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。
1．结果
记录两种灭菌效果于下表中
处理方法
平板菌落数
123
灭菌效果比较
紫外线照射
3%～5%石炭酸+紫外线照射
2%～3%来苏尔+紫外线照射
2．思考题。
（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？
（2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？
为什么不用普通灯用玻璃？
（3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？
四微孔滤膜过滤除菌
1．了解过滤除菌的原理。
2．掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。
过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。
根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。
微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。
根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。
此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。
1．培养基2%的葡萄糖溶液，肉汤蛋白胨平板。
2．仪器或其他用具注射器，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。
l．组装、灭菌
将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.lMPa，121.5℃灭菌20min）。
2．连接
将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。
见图2—3。
3．压滤
将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。
压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶．
4．无菌检查
无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃温室中培养24h，检查是否有菌生长。
5．清洗
弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。
整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。
l．结果
记录无菌检查结果
2．思考题
（1）你做的过滤除菌实验效果如何?
如果经培养检查有杂菌生长，你认为是什么原因造成的?
（2）如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度（或工作浓度）为50μg/ml，你将如何操作?
（3）过滤除菌应注意哪些问题?
实验3土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术
学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线方法分离微生物。
3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和普通变形菌（Proteusvulgaris）斜面菌种。
已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水（带玻璃珠）1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头（用75%乙醇浸泡）、玻璃刮。
（一）土壤稀释分离
1．取土壤取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．制备稀释液（要无菌操作）
（1）制备土壤悬液：
称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底力最好），振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
（2）稀释：
用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液（图3-1）。
注意：
操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
]
图3—1稀释法分离土壤微生物操作过程图解
3.混菌法测定菌落数的方法
（1）细菌：
取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。
倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。
图3—2倒平板的方法
（2）放线菌：
取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
（3）霉菌：
取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。
4．培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。
观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
（二）平板制作及划线分离方法。
1．倒平板按无菌操作要求，在火焰旁操作（图3—2），做法如3
（1）。
2．划线分离使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图3—3。
图3—3平板划线方法示意图
A.划线分离操作;
B.用于稀释液中,可连接划线;
C.用于较浓的菌样,分数次划线,每次划线后要烧接种环,然后再划下一区。
3．培养方法同“土壤稀释分离”。
（三）斜面接种和穿刺接种
1．斜面接种
（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。
（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）。
注意划线要轻，不可把培养基划破。
图3—4斜面接种（A）及穿刺接种（B）示意图
（3）接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。
2．穿刺接种
（1）取两
升级会员 