中药生物技术 复习.docx
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中药生物技术复习
绪论
生物技术：
应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料
进行加工以提供产品来为社会服务的技术
生物工程（Bioengineering）：
是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需产品或达到某种目的一门高技术学科。
中药生物技术（BiotechnologyofChineseTraditionalMedicine）：
是以植物学、动物学、微生物学、生物化学、天然产物化学等现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它学科的科学原理，针对中药和天然药物及其活性成分研究、开发和生产中存在的具体问题，按照预先的设计，进行生物体改造或生物原料加工，使其符合中药现代化和产业化要求的一门科学技术
生物组合化学：
将具有明确生物活性的天然化合物或活性组分，在具有多种催化作用的微生物、植物组织或酶的作用下转化成为新的组合型天然化合物群/库，再通过药理筛选手段寻
找新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物，并对活性化合物体内外生物转化情况进行考察，改善药物体内生物利用度及发现活性化合物的活性中心的一门新型交叉学科
多基因病：
疾病的发生和发展是多基因或多通路间平衡失调的结果，疾病基因组学的研究已突破了以往一个基因一种病的思维模式。
如癌症基因，约数百个；
疾病相关基因的网络：
利用生物大分子相互作用和网络调控的思维模式来研究和分析疾病基因的作用；
基因组的多样性和进化规律：
研究群体和个体在生物学形态以及在对疾病的易感性／抗性上的基因差异；
基因组的表达和调控：
研究群体和个体在整个生长发育过程或反应通路的基因表达网络机制，如一方面大多数细胞中基因的产物都要与其他基因产物相互作用，另一方面在发育过程中大多数基因产物都在多时间和空间表达并发挥其功能，形成基因表达的多效性。
中药生物技术的主要研究内容？
基因工程（geneengineering）：
生物体的遗传性状都是由基因决定的，而基因的物质基础是DNA。
基因工程是一种通过对基因的重组、转移、定位等方法人为改变生物的形态和功能的工程。
细胞工程（cellengineering）是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。
包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。
主要内容包括:
细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。
发酵工程（fermentationengineering）：
传统上发酵工程是指利用微生物的作用并通过近代工程技术来实现有用物质的工业化生产或其他产业过程的技术体系。
目前，随着生物技术的发展，利用植物细胞、动物细胞及DNA重组技术改造的微生物来进行工业化生产的过程也列入现代发酵工程的范畴。
酶工程（enzymeengineering）：
酶是具有特异催化功能的蛋白质，利用酶的催化作用进行物质的生物合成/生物转化来生产有用物质的技术，称为酶工程。
蛋白质工程（proteinengineering）：
蛋白质是生命活动的体现者。
蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学、生物信息学的研究获得关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，并在此基础上对通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终实现产业化的技术过程
生物技术相关学科与中药现代化的关系
1细胞和分子生物学与中医药的关系：
细胞和分子生物学是基础医药学各学科间联系的纽带
2基因组学与中医药的关系：
基因组学主要包括：
疾病基因组学：
主要研究定位克隆、多基因病、疾病相关基因的网络概念；
功能基因组学：
从生物学整体观的角度出发，研究基因组的多样性和进化规律，基因组的表达和调控，模式生物体基因组研究等
研究思路，都与中医药理论中整体观念、辨证施治、阴阳学说等有许多相似之处，这为中医药现代化研究提供了契机。
如能将中医药基本理论主动地应用于基因组学的研究思
路，将中医药基本理论与基因组学研究方法和理论相比较、相交融，将会使中医药学在未来医学和生物学中占有重要地位，同时也可为中医药现代研究跨越式的发展提供崭新的研究思路和方法。
未来的基因组和后基因组学研究将把医疗保健带入一个崭新的时代：
„医疗方面，将由目前主要是依赖经验转向以特异的分子病理学为依据；治疗方面，不断地把患病后高成本、低疗效的治疗转变为以患病前预测疾病为依据的预防式治疗（未病先防）。
上述“以人为本”、“预防为主”的医学模式与中医辨证施治的诊治模式不谋而合。
如能将中医证候诊断与现代的基因诊断相结合；把证候诊断观察到的表观现象与基因诊断发现的疾病发病基因相关联；不论对研究功能基因组学、疾病基因组学、蛋白组学中相关基因组或蛋白组的异常表达，还是研究中医证候外观表象的内在发病机制，均有着极为重要的意义，两者的有机结合将达到双赢的结果
3整体生物学、宏观生物学与中医药的关系：
整体生物学（integrativebiology）是在有机体整体水平上研究生物的结构、功能和生命活动过程，进而解释从
细胞、组织直至生态系统的生命现象。
它是后基因组学研究的更高层次。
宏观生物学（macrobiology）是以种群、群落、生态系统及全球系统的生命现象为研究对象，涉及动物-植物相
互作用关系、生物多样性、进化与系统发育、生物超微结构与功能形态学、生物通信等研究领域。
生命科学研究领域将向微观和宏观两个方向发展。
鉴于医学模式已经由以往的“生物医学”向“生物-心理-社会医学”转变，由单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，宏观生物学必将引起医药相关领域的深刻变革。
将中医药理论思想与现代宏观生物学的学术思想交互融合，符合中医药现代化的内涵并有助于其国际化进程。
4现代生物技术与中药学的关系
简述中药生物技术发展前景
1中医药基础研究将更加借助于生命科学技术手段
2生物技术将使原始的中药农业步入现代经济农业产业的轨道
3细胞和酶工程技术将使名贵濒危中药材及其活性成分的生产实现产业化
4生物技术将贯穿到中药新药研制的全过程
植物基因工程
基因（gene）（question）
定义1：
有遗传功能的DNA/核苷酸片段。
定义2：
存在于细胞内有自体复制能力的遗传物质单位。
定义3：
遗传信息的基本单位。
一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸
转录因子（Transcriptionfactors，TFs）：
转录因子（transcriptionfactor）是一群能与基因5’端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
根据转录因子的作用特点可分为两类；第一类为普遍转录因子,它们与RNA聚合酶II共同组成转录起始复合体，转录才能在正确位置开始。
TFIID以外
，还发现TFIIA，TFIIF，TFIIE，TFIIH等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。
第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素、生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。
一次代谢及一次代谢产物：
糖、蛋白质、脂质、核酸等是对植物机体生命活动必不可少的物质，称为一次代谢产物，也称为初级代谢产物；上述物质产生过程对维持植物生命活动来说是必不可少的过程，且几乎存在于所有的绿色植物中，此过程称为一次代谢，也称为初级代谢。
二次代谢及二次代谢产物（Question）：
特定条件下，一次代谢产物作为原料或前体，又进一步经历不同的代谢过程，这一过程并非在所有植物中都发生，对维持植物生命活动亦不起重要作用，此过程称为二次代谢，也称为次生代谢
；生成的萜类、生物碱等化合物称为二次代谢产物，也称为次生代谢产物。
代谢组学：
旨在研究某个生物体或某个组织甚至单细胞的全部代谢物及其动态变化。
就当前的仪器分析水平而言，这是一个无法完成的任务，而次生代谢产物的存在使得植物代谢成分高通量全面（comprehensive）分析更加困难。
因此，有学者提出代谢组学应当重新定义，应当对特定条件下代谢表型（metabolicphenotypes），以及这些表型与基因型之间的联系的研究。
抗病毒植物基因工程：
是利用植物基因工程的方法，将抗性基因转入植物体内，使植物获得遗传保护功能，它为防治病毒提供了一条新的途径。
外壳蛋白：
（coatprotein,CP）是一种存在于绝大多数病毒中的结构蛋白，也是病毒中含量最多的一种蛋白。
病
毒感染植物后首先在植物细胞内脱外壳，因此在病毒感染早期，被侵染细胞内存在很多游离的外壳蛋白。
目的基因转入植物的方法
„1利用农杆菌的Ti质粒进行转化
土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法。
优点：
不需要分离原生质体，操作简单、方便；植物细胞再生效率高；外源基因拷贝数较低，大多为单拷贝转
移，外源基因转入并整合到植物基因组中后不被修饰改变。
缺点：
难以转化大多数单子叶植物。
„2利用病毒感染进行转化
病毒载体的优点：
比较小，故易于实验室操作；不受单子叶或双子叶限制
缺点：
病毒所载的外源基因易被排斥出来或被消灭；病毒插入外源基因后容易丧失感染力；寄主范围窄。
„3物理转化方法
1基因枪法：
通过基因枪技术，很多植物都可以得到转化，故此方法是最有前途的植物DNA转移系统之一。
缺点：
使用此法时，外源基因整合到植物细胞基因组上的效率极低。
2电击法/电脉冲法
3激光微束穿孔法
4显微注射法
5脂质体介导法
6多聚物介导法
7花粉管通道法：
该技术操作简单，而且能避免体细胞变异等问题，因此有一定的使用价值和应用前景。
植物基因工程的主要内容：
„
（1）从种类繁多的植物基因群中分离目的基因；
„
（2）寻找或构建克隆载体；
„（3）重组载体导入植物细胞，并整合至其基因组上；
„（4）重组载体的植物细胞再生成正常植株；
„（5）再生植株通过有性过程，将外源基因传递给后代。
利用农杆菌的Ti质粒得到转基因植物的主要转化步骤?
目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。
Ti质粒的特点
该质粒上有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），其长度在12-24kb之间，它能转移并整合到植物基因中并导致冠瘿瘤的形成。
（T-DNA区域上有三个基因组：
tms，tmr和tmt，分别编码合成植物生长素、分裂素和生物碱的酶系。
生长素与细胞分裂素的大量合成导致植物冠瘿瘤的生长，因此tms和tmr基因被称为致瘤基因（onco-genes）。
tmt基因编码冠瘿碱合成酶，这种酶能催化一个氨基酸分子或一个酮酸分子与一个糖分子缩合成冠瘿碱，冠瘿碱可以为土壤农杆菌的生长提供碳源和氮源。
）
Ti质粒上与植物感染和致瘤有关的另一个重要部分是vir基因，该基因组大约35kb，其编码产物作为反式蛋白因
子促进植物细胞的转化。
vir区基因对T-DNA的转移是必需的，但不与T-DNA直接相连。
Vir表达产物诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链线性拷贝。
该单链T-DNA从Ti质粒脱离后在vir基因表达产物（如VirD2蛋白等）的引导下穿过农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、植物细胞壁、细胞模及核模，最后整合到植物细胞的染色体中。
Ti质粒用于植物基因转化的主要方法?
（1）原生质体共培养法：
用农杆菌转化已再生细胞壁的原生质体，通过选择获得再生植株。
这种方法需要有效
的原生质体再生方法，故实用范围有限。
（2）叶盘法：
将叶片或其它组织切割成段或用打孔器打成直径为1-1.5cm的圆盘，浸入土壤农杆菌培养液中几
钟，将组织表面多余的菌液吸去，然后置于合适的培养基上培养。
外植体在培养基上与农杆菌共培养（2d以
上），选择转化植株。
转化植物细胞的选择与转基因植株的鉴定
1转化植物细胞的选择：
目前对转化细胞的选择主要是利用标记基因来进行，最常用的标记基因为抗生素抗性基因，
如抗卡那霉素（kanamycin）抗性基因，即NPTII（neomycinphosphtransferaseII：
新霉素磷酸转移酶II）基因，可用于许多双子叶植物的转化细胞，如烟草、番茄、马铃薯等，有些植物对卡那霉素不敏感，可选择另外一些抗生素如MTX（methotrexate,甲氨蝶呤）或HYG（hygromycin,潮霉素）等。
2胭脂碱合成酶基因鉴定：
胭脂碱合成酶基因是土壤农杆菌Ti质粒上的一个基因，其表达产物胭脂碱合成酶能催化生成胭脂碱（nopaline），后者经一定操作后可在紫外光下直接检测。
将经过选择的转化细胞所形成的愈伤组织或植株取一部分，经过纸层析，在紫外光下直接检测胭脂碱合成酶基因表达后的生成物，即可对植株进行鉴定。
3报告基因鉴定：
1大肠杆菌的GUS基因：
将无色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖醛酸水解，产生蓝色的水解产物
2CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因：
用转化的植物、植物细胞或愈伤组织提取物与14C标记的氯霉素及乙酰辅
酶A进行反应，然后测定有多少氯霉素被乙酰化
3荧光素酶基：
转化过的植物细胞与荧光素、ATP混合，荧光素酶可催化荧光素的氧化反应，生成AMP、CO2和光，利用胶片感光的方法进行检测和示踪
4绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因：
表达产物为238个氨基酸组成的蛋白质。
该蛋白性质极其稳定，而在高温、紫外光激发下发绿色荧光（最大吸收峰为395nm）
植物细胞结构的主要特征是什么?
1、细胞壁.主要成分为纤维素和果胶.由三部分组成：
包间层、初生壁、次生壁.功能：
维持细胞的形状,防止水分损失.
2、叶绿体.双层膜、含有叶绿素,能进行光合作用.
3、液泡.单层膜,液体中主要成分为水.功能：
贮存物质（糖类、蛋白质、色素等）、调节细胞内环境.
植物次生代谢途径基因修饰的主要策略是什么
（1）导入单个、多个靶基因或一个完整的代谢途径，使宿主植物合成目标产物的含量大大提高（如青蒿酸）或生成新的目标物质；
（2）通过反义RNA和RNA干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改变代谢流向和增加目标物质的含量；
（3）对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效的调控植物次生代谢以提高特定化合物的积累。
目前，在基因水平上研究的最清楚的植物次生代谢途径是合成黄酮类及花青素的次生代谢途径。
在中间产物和酶水平上对其他次生代谢途径所进行的详细研究已经鉴定了许多具有重要医药价值的次生代谢产物，如吲哚和异喹啉生物碱等。
抗病虫害中药材基因工程的主要优点是什么
（1）化学或生物杀虫剂在一个生长季节通常需喷洒6-8次，而抗虫品种一旦培育成功就可能获得对害虫的连续抗性，在植物整个生长周期都有保护作用，故成本低；
（2）保护作用遍及全株，故可使化学或生物杀虫剂很难接触的部位（如根部）受到保护；
（3）抗虫基因存在于植物体内，扩散的可能性很小，因此安全性好；
（4）多数抗虫基因具有很强的特异性，只杀死摄食害虫，而对其它生物没有影响。
药用植物细胞工程技术
细胞工程（cellengineering）
定义1（广义）：
细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术；
定义2（狭义）：
细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术
植物细胞的全能性：
植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。
原因（基础）：
生物体的每一个细胞都含有发育成为完整个体所必需的全部基因
植物组织培养（planttissueculture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（如花药组织、形成层、胚珠、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞、花粉等）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件（含有营养物质和植物生长调节物质等），使其生长发育的技术。
外植体：
在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分无菌的组织或器官叫做外植体。
继代培养：
“第一代培养”：
第一代培养是指由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代进间而称之为“第一代培养”。
第一代以后的培养就称之为继代培
培养基：
人工配制的适合于不同生物体生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料。
维管组织（vasculartissue）：
由木质部和韧皮部组成的输导水分和营养物质，并有一定支持功能的植物组织。
为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成不同的组织、器官？
基因在特定空间及时间条件下选择性表达的结果。
在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。
植物细胞工程的主要研究内容。
原理：
细胞全能性的本质；细胞分化机理；代谢途径的调控；培养细胞生理和遗传的变异；不亲和性机制；细胞大规模培养动力学参数的建立
技术：
细胞和组织培养方法的改进；细胞器的分离和引入；原生质体融合、杂种培养筛选和鉴定；培养细胞中有用成分的鉴别、分离和分析；试管苗的大规模
植物组织培养的基本过程。
发展历程
1探索阶段（从20世纪初到30年代中）：
Haberlandt:
贡献：
提出细胞全能性假说；首次进行离体细胞培养
2奠基阶段（20世纪30年代中-50年代中）：
1952：
Morel和Martin首次报道茎尖的离体培养，获得无毒大丽花植株1952-1953：
Steward用胡萝卜根细胞悬浮培养，发现单细胞能像受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株，证实了植物细胞全能性学说。
1954：
Muir成功培养烟草单细胞
3蓬勃发展阶段（20世纪50年代末以来）原生质体培养取得重大突破：
1971年，首次由烟草原生质体获得了再生植；花药培养取得显著成绩：
1967年，通过花药培养获得了完整的烟草植；微繁技术得到广
泛应用
植物组织培养的应用
1在植物脱毒和快速繁殖上的应用
2植物育种上的应用：
（1）单倍体育种
（2）胚胎培养（3）细胞融合（4）基因工程遗传操作（5）培养细胞突变体
3在植物有用产物上的应用
4在植物种质资源保存和交换上的应用：
人工种子；低温保存
5在遗传、生理、生化和病理研究上的
不同植物类群诱导愈伤组织的易难顺序？
细胞核已开始解体的筛管和木质部成分，或细胞壁厚于2µm的植物纤维细胞（成熟的管胞壁厚达7µm）不再具有分
裂能力。
灭菌剂
最常用的灭菌剂次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。
次氯酸钙多用市售工业用漂白粉，因有效氯含量不稳定，故常用其过滤后的过饱和溶液。
该溶液特别适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，灭菌时间一般为5~30min。
氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难，且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物细胞。
氯化汞作为休
眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，用于有较厚种皮的休眠种，灭菌时间一般为2～10min。
培养基
1培养基营养物质组成的化学成分：
（1）合成培养基：
化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，适用于各种生长指标的测定。
但微生物生长较慢，而植物细胞生长良好。
如MS（MurashigeandSkoog）培养基等。
（2）半合成培养基：
在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分。
这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。
（3）天然培养基：
由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。
这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用作为微生物的培养基。
2培养基的物理形态：
（1）液体培养基：
液体培养基中不加任何凝固剂。
这种培养基的成分均匀，生物体能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，常用于发酵工业。
（2）固体培养基：
在液态培养基中加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等。
固体培养基常用于诱导植物细胞愈伤组织，生物体分离、鉴定、计数和细胞株保存等方面。
（3）半固体培养基：
是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。
可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
3培养基的用途：
（1）增殖培养基：
根据某种生物体生长的需要，在培养基中加入有利于该种生物体生长、繁殖的营养物质，以提高对这种生物体的分离效率。
（2）选择培养基：
在培养基中添加某些对所需要的生物体没有影响而对其它生物体具有抑制作用的物质，使所需要的生物体生长良好，这种培养基对某种生物体具有严格的选择性，称为选择培养基。
（3）鉴别培养基：
在培养基中加入某种指示剂，使不易区分的生物体经过培养后，由于代谢的不同而对指示剂的反应呈现明显的差异，有助于鉴别不同生物体的培养基。
愈伤组织的形成过程
1诱导期：
外植体细胞进行分裂准备的时期。
此间，外植体细胞大小虽然没有明显变化，但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。
2分裂期：
外植体外层细胞开始迅速分裂。
在此时期，由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速度
，故细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。
当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，
RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期。
3形成期：
外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织时期。
进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，细胞的分裂由原来局限在组织外源的平周分裂转为组织内部较深层局部的分
裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称为分生组织结节。
获得优良愈伤组织的策略
1选择适当的基因型和适当的外植体
•同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同
•同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同
2选择正确的培养基
•正确的植物激素的种类、浓度以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间的配比。
3采用某些特殊的理化因素改变诱导培养基和培养条件
•如：
玉米幼胚愈伤组织培养，添加5mg/L或10mg/LAgNO3以抑制组织内乙烯，从而使愈伤组织的频率由对照的4.9%分别提高到26.9%和34.0%
影响维管组织分化的因子有哪些？
1生长素：
含有蔗糖和生长素的琼脂能有效地取代芽的作用，同样能够诱导维管组织的分化。
2蔗糖：
浓度：
当培养基中含有低浓度生长素时，通过改变蔗糖浓度，即可改变洋丁香和菜豆愈伤组织块中所形成的木质部和韧部的相对数量。
1％蔗糖，形成少量的木质部分子
2％蔗糖，有利于木质部的形成
2.5％~3.5％蔗糖，木质部和韧皮部都能分化
种类：
除了蔗糖之外，属于二糖的麦芽糖和海藻糖也能刺激菜豆愈伤组织导管的分化。
葡萄糖、果糖和其他单糖则无刺激作用
3细胞分裂素和赤霉素对维管组织分化的作用与物种有关。
4物理因子：
。
在向日葵中，温度若低于17℃，导管分子不能分化，在17~31℃的范围内，木质部的形成随温度的
增加而增加。
另外，光对洋紫苏创伤导管的分化有刺激作用
烟草表皮细胞及冠瘿瘤细胞如何表现出全能
当由正在开花的烟草植株的茎撕取薄层表皮进行培养时，它们所形成的芽的类型因茎的取材区域
而不同。
在一定的培养条件下，由花枝撕取下来的薄层表皮只能产生花芽，由植株基部撕取下来的薄层细胞只能产生营养芽，由中间部分取得的外植体能产生这两种类型的芽，但其间的比例会有不同，这取决于它们与植株基部距离的远近。
只有当培养基中所含的激动素和IAA的浓度皆为
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