五微生物的营养和培养基.docx
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五微生物的营养和培养基
第五章微生物的营养和培养基
营养（nutrition）：
指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。
营养物（nutrient）：
指具有营养功能的物质，那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。
在微生物学中，它还包括非常规物质形式的光辐射能在内。
第一节微生物的6类营养要素
——碳、氢、氧、氮、硫、磷
——碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水
一、微生物细胞的化学组成
1.化学元素（chemicalelement）
主要元素：
碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等；
微量元素：
锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。
Eg.细菌、酵母菌和真菌的碳、氢、氧、氮、磷、硫六种元素的含量就有差别。
硫细菌（sulfurbacteria）、铁细菌（ironbacteria）和海洋细菌（marinebacteria）相对于其他细菌则含有较多的硫、铁和钠、氯等元素,硅藻（Diatom）需要硅酸来构建富含（SiO2）n的细胞壁。
二、微生物的6类营养要素
在元素水平上都需20种左右，且以碳、氢、氧、氮、硫、磷6种元素为主；
在营养要素水平上则都在六大类的范围内，即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。
微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”
（一）碳源（carbonsource）
1.定义
一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物，称为碳源。
微生物细胞含碳量约占干重的50％，除水分外，碳源是需要量最大的营养物，又称之为大量营养物（macronutrients）。
碳源谱（spectrumofcarbonsources）：
宝贵的氮源
———“C.H.O.N”和“C.H.O.N.X”型，——尽量避免将之作为廉价的碳源使用。
异养微生物在元素水平上的最适碳源———“C.H.O”型
微生物能利用的碳源类型大大超过了动物界或植物界所能利用的碳化合物。
有机碳：
凡必须利用有机碳源的微生物，就是为数众多的异养微生物。
无机碳:
凡以无机碳源作主要碳源的微生物，则是种类较少的自养微生物。
对一切异养微生物来说，其碳源同时又兼作能源，这种碳源称为双功能营养物
2.种类
微生物的碳源物质很多，有糖类及其衍生物、有机酸类、醇类、脂类、烃类、蛋白质及其降解产物等。
不同种类的微生物对碳源的利用能力也不一样！
Eg.假单胞杆菌属的一些菌能利用90多种不同的碳源物质。
甲烷氧化菌只能利用甲烷和甲醇作碳源。
（1）糖
单糖＞双糖和多糖
己糖＞戊糖
葡萄糖、果糖＞甘露糖、半乳糖
淀粉＞纤维素或几丁质等纯多糖
纯多糖＞琼脂等杂多糖
葡萄糖可作为大多数微生物的碳源！
2）酚、氰化物等有毒物质
对人类有毒的物质Eg.酚、氰化物等——某些微生物Eg.诺卡氏菌和一些霉菌等
（3）CO2
最廉价的、用之不尽的碳源，是自养微生物唯一或主要的碳源。
Eg.生长在动物血液、组织和肠道中的致病细菌（沙门氏菌、李斯特菌等）
4）纤维素
纤维素是由葡萄糖以β－1,4糖苷链组成的，在自然界中资源丰富，但大多数动物和人不能直接利用，而某些微生物可用其作为碳源来生产发酵产品
（5）烃类
烃类化合物也能被微生物用作碳源，且微生物氧化烃类的许多中间产物和最终产物均是重要的工业原料。
——清除石油污染
在发酵工业中最常用的碳源是葡萄糖、淀粉、废糖蜜、麸皮和米糠等。
3.功能
（1）构成细胞物质
（2）构成各种代谢产物和细胞贮藏物质
（3）为微生物进行生命活动提供能量
（二）氮源（nitrogensource）
1.定义
凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。
氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，氮占细菌干重的12％～15％，也是微生物的主要营养物。
异养微生物对氮源的利用顺序是：
“N.C.H.O”或“N.C.H.O.X”＞“N.H”＞“N.O”＞“N”
氮源谱（nitrogenofnitrogensources）：
有机氮；无机氮；分子氮
微生物能利用的氮源类型也明显比动物或植物的广。
a.有机氮
主要由蛋白质及蛋白质的各种降解产物
———蛋白胨、氨基酸、小肽和尿素等。
实验室常用的有机氮源有：
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、
蚕蛹粉、黄豆粉和花生粉等。
b.无机氮
主要包括硝酸盐、铵盐、铵等。
铵盐是绝大部分微生物的有效氮源，吸收后能被直接被利用；
硝酸盐也能被大部分微生物利用，但吸收后需被还原成NH3才能进入合成代谢。
铵盐Eg.（NH4）2SO4作氮源，随着NH4＋的消耗培养基的pH值下降。
铵盐被称作生理酸性盐
硝酸盐Eg.KNO3作氮源，随着NO3－的消耗培养基的pH会上升。
硝酸盐被称作生理碱性盐
铵盐和氨基酸被微生物吸收后能直接被利用——速效氮源
NO3－和蛋白质吸收后还需还原降解才可利用——迟效氮源
c.分子氮
分子氮即为大气中的N2。
能利用N2作氮源来合成细胞结构的微生物我们称固氮微生物。
（1）研究微生物的固氮作用是生物领域中的一个重大课题。
通过基因工程把微生物的固氮基因转移到高等植物的基因组中，使之可利用N2。
2）固氮微生物具有固氮酶，可在常温常压下把
N2+H2——NH3
研究固氮酶作为一种酶制剂生产出来，在进一步在生产NH3。
3.功能
构成细胞物质
构成代谢产物
氮源物质一般不提供能量，但也有例外：
硝化细菌，它能利用NH3氧化获得能量，NH3既是氮源又是能源。
一部分微生物是不需要利用氨基酸作为氮源的，它们能把尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等简单氮源自行合成所需要的一切氨基酸，称为氨基酸自养型微生物（aminoacidautotrophs）。
凡需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源的微生物就是氨基酸异养型微生物
（三）能源（energysource）
1.定义
能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源。
化能自养微生物的能源为一些还原态的无机物质，
Eg.NH4+、NO2-、S、H2S、H2和Fe2+等。
能氧化利用这些物质的微生物都是细菌，
Eg.硝酸细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。
单功能营养物——某一营养物只能有一种营养要素功能。
Eg.光辐射能（能源）
双功能营养物——某一营养物兼有两种营养要素功能。
Eg.还原态的无机物NH4+（氮源、能源）
三功能营养物——某一营养物兼有三种种营养要素功能。
Eg.氨基酸类（碳源、氮源、能源）
（四）生长因子（growthfactor）
1.定义
是一类调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的需要量很小的一类有机物。
（1）生长因子自养型微生物（auxoautotrophs）
它们不需要从外界吸收任何生长因子，多数真菌、
放线菌和不少细菌，如E．coli（大肠杆菌）等都属这类。
（2）生长因子异养型微生物（auxoheterotrophs）
它们需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长，如各种乳酸菌、动物致病菌、支原体和原生动物等。
（3）生长因子过量合成微生物
少数微生物在其代谢活动中，能合成并分泌出大量的维生素等生长因子，可作为有关维生素的生产菌种。
2.种类
广义的生长因子：
维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4～C6的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；狭义的生长因子：
一般仅指维生素。
a.维生素
维生素作为一些酶的辅酶，
Eg.维生素B6（吡哆醛），
磷酸吡哆醛是一些转氨酶和氨基酸脱羧酶的辅酶。
微生物对维生素的需要量一般是1～5mg／ml
b.氨基酸
氨基酸是蛋白质合成的基本单位，在大多数情况下可被微生物吸收利用；少数情况下微生物虽需要氨基酸作为生长因子，但氨基酸不能透过细胞膜，而能够吸收利用小肽。
在培养基中一种氨基酸的含量过高，会抑制细胞对其他氨基酸的摄取，此现象称氨基酸不平衡。
微生物对氨基酸的需要量一般是20mg／ml
c.碱基
碱基是核酸、核苷酸及一些辅酶的组分；
一般情况下，核苷酸不能用作生长因子，因为它不能透过细胞膜。
微生物对碱基的需要量一般是10～20mg／ml
d.其他生长因子
有些微生物的生长需要一些很特殊的物质，也称生长因子。
Eg.流感嗜血杆菌一定要在含红细胞的培养基上生长，因为它需要卟啉环作生长因子。
厌氧条件下生长的啤酒酵母需要甾醇作为生长因子。
在配制微生物培养基时，一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要。
Eg.如果配制的是天然培养基，则可加入
酵母膏（yeastextract）、
玉米浆（cornsteepliquor，一种浸制玉米以制取淀粉后产生的副产品）、
肝浸液（liverinfusion）、
麦芽汁（maltextract）、
其他新鲜的动、植物的汁液；
如果配制的是组合培养基，则可加入复合维生素溶液。
3.生长因子的微生物分析法
微生物分析法就是利用营养缺陷型的生长量和其所必需的生长因子的浓度在一定范围内呈正比的关系来测定的。
优点：
特异性强，灵敏度高，
Eg.维生素在毫微克／ml以下的浓度均可测定。
（五）无机盐（mineralsalts）
1.定义
无机盐（mineralsalts）或矿质元素主要可为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素。
（1）大量元素（macroelements）
凡是生长所需浓度在10-3～10-4mol／L范围内的元素，可称为大量元素（macroelements），
例如P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等。
2）微量元素（microelements）
凡所需浓度在10-6～10-8mol／L范围内的元素，则称为微量元素（microelements），
如Cu、Zn、Mn、Mo、Co和Ni、Sn、Se等。
（六）水
微生物细胞中水占70～90％，
水是地球上整个生命系统存在和发展的必要条件！
水在生物体内的作用
（1）水是细胞的重要组成成分。
（2）水直接参与代谢反应，许多反应都涉及脱水和水合。
（3）水是活细胞中各种生化反应的介质。
（4）营养物质、代谢产物都必须溶于水中才能被运输。
（5）水比热高、气化热高、沸点高，又是热的良导体，可调节细胞的温度。
（6）水是维持细胞。
水是细胞维持正常生命活动所必不可少的，
一般可占细胞重量的70~90%。
细胞湿重（wetweight）与干重（dryweight）之差为细胞含水量，
常以百分率表示：
湿重-干重/湿重×100%。
湿重：
将细胞外表面所吸附的水份除去后称量所得重量，一般以单位培养液中所含细胞重量表示（克/升或毫克/毫升）。
干重：
采用高温（105℃）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为～。
（七）气体
1.氧气
需氧微生物的能量代谢需要氧气的存在，微生物发酵中给氧的方法有搅拌、振荡，通气等。
2.CO2
CO2是自养微生物的碳源，也常被异养微生物用于固定延长碳链。
Eg.丙酮酸羧化为草酰乙酸
有些生长在动物体内的致病菌生长需要少量的CO2，在培养时要提供10％的CO2（V/V），可用CO2培养箱。
第二节微生物的营养类型
——营养类型是指根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源的不同，而划分的微生物类型。
1.光能无机营养型
（光能自养型，photoautotroph）
能以CO2为主要唯一或主要碳源；
进行光合作用获取生长所需要的能量
以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质；
例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。
而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。
2.光能有机营养型
（光能异养型，photoheterotroph）
以CO2及简单有机物为碳源；
以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；
在生长时大多数需要外源的生长因子；
这类微生物能利用有机物迅速繁殖，常用于污水处理。
例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。
光能无机自养型和光能有机异养型微生物可利用光能生长，
在地球早期生态环境的演化过程中起重要作用。
3.化能无机营养型（化能自养型，chemoautotroph）
生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能；
以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作为电子供体使CO2还原成细胞物质。
可在完全无机及无光的环境中生长。
它们广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环。
4.化能有机营养型（化能异养型，chemoheterotroph）
生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；
生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，
如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。
有机物通常既是碳源也是能源！
大多数细菌、放线菌、原生动物、几乎全部的真菌都是化能有机异养型微生物；
所有致病微生物均为化能有机异养型微生物；
不同营养类型之间的界限并非绝对：
异养型微生物并非绝对不能利用CO2；
自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长；
有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变；
例如紫色非硫细菌（purplenonsulphurbacteria）：
没有有机物时，同化CO2，为自养型微生物；
有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微生物；
光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物；
黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物；
微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力
第三节营养物质进入细胞（自学）
——单纯扩散，促进扩散，主动运送，基因移位；
基因移位：
一类即需要特异性载体蛋白的参与，又需耗能的一种物质运送方式。
其特点是溶质在运送前后还会发生分子结构的变化。
第四节培养基
培养基（medium，复数media；或culturemedium）
是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。
（参见P91）
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，其间的比例是合适的？
绝大多数微生物都可在人工培养基上生长，只有少数难养菌（fastidiousmicroorganisms）至今无法在人工培养基上生长。
一、选用和设计培养基的原则和方法
（一）配制培养基的4个原则——目的明确，营养协调，理化适宜，经济节约
1.目的明确
培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；
培养目的不同，原料的选择和配比不同；
例如枯草芽孢杆菌：
一般培养：
肉汤培养基或LB培养基；
自然转化：
基础培养基；
观察芽孢：
生孢子培养基；
产蛋白酶：
以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。
2.营养协调
微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。
微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。
在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：
（1）选择适宜的营养物质
实验室的常用培养基：
细菌：
牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；
放线菌：
高氏1号合成培养基培养；
酵母菌：
麦芽汁培养基；
霉菌：
查氏合成培养基；
实验室一般培养：
普通常用培养基；
遗传研究：
成分清楚的合成培养基；
生理、代谢研究：
选用相应的培养基配方；
（2）营养物质浓度及配比合适
营养物质的浓度适宜；
营养物质之间的配比适宜；
高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C／N）的影响较大。
碳氮比（C／N）比：
碳源含量/氮源含量
碳源中碳原子的摩尔数/氮源中氮原子的摩尔数
发酵生产谷氨酸时：
碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；
碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。
真菌需C／N比较高的培养基；（素食）
细菌（动物病原菌）需C／N比较低的培养基；（荤食）
NH3＞CO（NH2）2＞NH4NO3＞（NH4）2CO3＞（NH4）2SO4
含氮量（82％）（46％）（35％）（29.2％）（21％）
在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。
3.理化适宜
指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。
1）pH
各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。
通常培养条件：
细菌：
pH7.0~8.0
放线菌：
pH7.5~8.5
酵母菌：
pH3.8~6.0
霉菌：
pH4.0~5.8
藻类：
pH6.0~7.0
原生动物：
pH6.0~8.0
嗜极菌（extremophiles）
在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。
——pH的调节
①pH的内源调节
通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。
内源调节主要有以下两种方法：
第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。
［K2HPO4］/［KH2PO4］＝1时，溶液的pH稳定在6.8。
调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH6.0～7.6间的一系列稳定的pH。
反应原理：
K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KCl
KH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O
第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。
CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。
反应是：
②pH的外源调节
这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。
4.经济节约
配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,
特别是在发酵工业中,以降低生产成本。
（1）以粗代精
（2）以“野”代“家”
（3）以废代好
（4）以简代繁
（5）以氮代朊
（6）以纤代糖
（7）以烃代粮
（8）以“土”代“洋”
（二）4种方法——
1.生态模拟
直接取用这类天然基质（经过灭菌）或模拟这类自然条件，就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相应的微生物。
2.参阅文献
（1）直接经验
（2）查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息
3.精心设计
4.试验比较
试验的规模一般都遵循由定性到定量、由小而大地，逐步扩大的原则。
例如，先在培养皿琼脂平板上测试某微生物的营养要求，
然后作摇瓶培养（shakeculture）试验，
再进行台式发酵罐培养试验，
最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模。
二、培养基的种类
（一）按对培养基成分的了解作分类
1、天然培养基
这是指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。
例如，培养多种细菌的牛肉膏蛋白胨培养基，
培养酵母菌的麦芽汁培养基等。
天然培养基的优点：
营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉。
缺点：
是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。
天然培养基只适合于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。
2、组合培养基
又称合成培养基或综合培养基（syntheticmedia），是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。
例如，培养细菌的葡萄糖铵盐培养基，
培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（即高氏一号培养基），
培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基（即察氏培养基）等。
组合培养基的优点：
成分精确、重演性高。
缺点：
价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。
组合培养基仅适用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等
对定量要求较高的研究工作中。
3、半组合培养基
又称半合成培养基（semi-syntheticmedia），指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。
例如，培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。
严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何组合培养基，因其中含有一些未知的天然成分，故实质上都只能看作是一种半组合培养基。
（二）按培养基外观的物理状态作分类
1.液体培养基（liquidmedia）
一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模的培养微生物。
2.固体培养基（solidmedia）
广义：
一类外观呈固体状态的培养基。
狭义：
在液体培养基中加入凝固剂，使之成为固体的培养基。
固体培养基为微生物生长提供一个营养表面，微生物在这表面上可以形成单个菌落。
根据固体的性质又可把它分为4种类型：
（1）固化培养基（solidifiedmedium）
常称“固体培养基”，由液体培养基中加入适量的凝固剂（gellingagent）而成。
例如，加有1～2％琼脂（agar）或5～12％明胶（gelatin）的液体培养基，可制成遇热可融化、冷却后则呈凝固态的用途最广的固化培养基。
凝固剂必须具有的特点：
a.不被微生物液化、分解和利用
b.在微生物生长的范围内保持固体状态
c.凝固点的温度对微生物无害
d.不因消毒灭菌的高温处理而破坏
e.配制方便、价格低廉
f.透明度好、粘着力强
常用的凝固剂：
琼脂（agar）、明胶（gelatin）、海藻酸钠（alginate）、脱乙酰吉兰糖胶（Gelrite）、多聚醇F127（pluronicpolyolF127）等。
除了用凝固剂配制固体培养基外，一些天然的固体营养物质也能制成固体培养基。
例如，马铃薯块、胡萝卜条和米饭等。
（2）非可逆性固化培养基
——指一类一旦凝固后不能在重新融化的固化培养基。
Eg.血清培养基或无机硅胶（silicagel）培养基等，其中的硅胶平板是专门用于化能自养细菌的分离、纯化等。
（3）天然固态培养基——由天然固态基质直接配制成的培养基。
例如，培养真菌用的由麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉等配制成的培养基；
由马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、面包、动物或植物组织直接制备的培养基。
（4）滤膜（membranefilter）
是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。
若把滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有营养液的纤维素衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。
滤膜主要用于对含菌量很少的水中微生物的过滤、浓缩，然后揭下滤膜，把它放在含适当营养液的衬垫上进行培养，待长出菌落后，可计算出单位水样中的实际含菌量。
3.半固体培养基（semi-solidmedia
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