M13噬菌体Word下载.docx

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用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:

6400。

噬菌体释放方式：

M13噬菌体溶源性，不裂解宿主菌。

极大地简化了每轮淘选过程中的噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法即可。

融合方式：

M13噬菌体N端与pIII蛋白融合，不适合克隆cDNA，因为cDNA中为oligod（T））常位于翻译终止密码子的下游。

融合序列大小：

M13噬菌体展示肽库为7肽、12肽和环7肽

NEBM13噬菌体展示肽库可用于定位抗原决定簇，确定蛋白质相互作用位点，鉴定酶的底物或抑制物，鉴定受体激活物或抑制剂，研制多肽药物，开发新药，肿瘤治疗和疫苗制造，用途广泛

M13噬菌体感染雄性大肠杆菌需要完整的F菌毛，通过F因子编码的性菌毛进入宿主细胞内，如果噬菌体DNA通过感染导入细菌，那么也可以感染雌性大肠杆菌，但是通过转染产生的子代颗粒不能感染培养基中的其他细菌，所以病毒的产量很少

单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备：

这个方案主要用于制备大量M13噬菌体的双链DNA，因在实验室中M13噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬菌体DNA，如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。

也许最重要的是，大规模制备和单链DNA可以分为小份，被实验室中所有人用作双脱氧测序反应和转染的标准对照。

方法:

M13噬菌体RFDNA制备:

1、将2.5ml铺板菌液转移至无菌试管（13*100mm或17*100mm）。

加0.5mlM13噬菌体原液（约5*1011pfu），轻拍试管壁混合，室温放置5min。

2、将感染细胞用装在2L摇瓶中的250ml预热至37℃的含5mmol/LMgCl2的LB或YT培养基稀释。

37℃持续振荡培养5h。

3、4℃4000g（SorvallGSA转头为5000r/min）离心15min收集感染细胞。

回收上清可用于按以下步骤7-17的方法大规模制备M13噬菌体的单链DNA.

4、细菌沉淀用100ml冰冷的STE重悬，4℃4000g（SorvallGSA转头为5000r/min）离心15min回收洗后的细胞。

5、用碱裂解法分离噬菌体闭合环状RFDNA。

适当增大裂解液的体积。

纯化DNA可用PEG沉淀或层析柱纯化或CsCl梯度离心。

6、用分光光度法测定DNA浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。

将闭合环状DNA分成小份-20℃冻存。

M13噬菌体单链DNA制备:

7、从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链DNA，将步骤3的上前转移至一家有磁搅拌子的500ml烧杯。

8、上清中加入10gPEG和7.5gNaCl，室温搅拌30-60min。

9、4℃10000g（SorvallGSA转头为7800r/min）离心20min收集沉淀。

倒置离心瓶2-3min，使上清流净，用Kimwipes纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。

10、瓶中加入10ml10mmol/L的Tris-HCl（PH8.0）,搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸干充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至30mlCorex离心管中。

11、在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡2min，混匀内容物。

12、室温以3000g（SorvallGSA转头为5000r/min）离心5min，上层水相转移至一个心管，再用10ml酚：

氯仿抽提。

13、用等量的水相转移至两个30mlCorex离心管中，各加入3mol/L乙酸钠（ph5.2）0.5ml和乙醇11ml。

充分混合后室温放置15min。

14、4℃12000g（SorvallSS-34转头为10000r/min）离心20min回收单链DNA陈丹，小心移去上清。

15、每个管中加入30ml4℃70%乙醇，4℃12000g（SorvallSS-34转头为10000r/min）离心10min，小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用Kimwipes纸巾吸干管颈处。

16、室温放置，使残余乙醇蒸发，用1mlTE（ph8.0）溶解沉淀，-20℃贮存。

17、用分光光度法测定DNA浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状DNA分为小份（10-50ug）-20℃贮存。

M13噬菌体特点是：

①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；

②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；

③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。

因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。

根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。

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M13噬菌体

大肠杆菌的m13噬菌体

当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体DNA转变成双链复制型（RF）。

从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。

当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时，M13开始不对称的合成，即只大量合成DNA双链中的一条链。

单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。

M13感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。

　　M13的基因组中除有一段507个核苷酸，其余都含有与其复制有关的遗传信息。

因此，只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性。

用M13作为分子克隆载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，其中包含了克隆DNA片段的二条互补链中的一条，因此可用来作为对DNA测序的模板。

另外，可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的RNA。

M13的RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源DNA。

从细菌培养液中大量抽取单链DNA。

问题是插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。

一般说，插入300～400bp是相当稳定的

2.M13噬菌体的生物学

M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。

感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

M13噬菌体的基因组为单链DNA（+DNA），由6407的碱基组成。

基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。

较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。

M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）。

所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。

基因组DNA为正链，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。

图4-9M13噬菌休

在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。

通过θ复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。

基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。

启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。

当基因Ⅱ蛋白在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。

此时，在大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用下，以负链为模板在切口的3'

末端加入核苷酸，并持续DNA的合成，用新合成的DNA替换原有的正链。

当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNA。

在感染开始的15～20分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RFDNA，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链DNA。

当感染细胞内累计有100-200个RFDNA时，细胞内也产生了足够的单链DNA结合蛋白，即基因Ⅴ蛋白。

该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因ⅡmRNA的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成RFDNA。

此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA。

另外，基因Ⅹ蛋白和基因Ⅴ蛋白也是噬菌体特异DNA合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内RFDNA的数量。

结果，感染细胞内RFDNA的数目和子代正链DNA的产生速率都能保持适度。

成熟噬菌体颗粒由11个病毒蛋白中的5个组成，至少4个其他蛋白（如基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅺ蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。

图4-10M13噬菌体在感染细胞中的复制

M13没有包装限制：

图4-11M13噬菌体的包装

3.M13载体的构建

单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链RFDNA。

RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。

（1）载体的插入位点

在M13噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。

基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区是主要的外源片段插入位点。

在基因Ⅷ和基因Ⅲ之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。

基因Ⅹ也可用来克隆外源片段。

（2）M13噬菌体载体组成

现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的区域作为外源DNA插入区。

mp载体系列都是从同一个重组M13噬菌体（M13mpl）改造而来的。

在M13mpl载体中，间隔区内的HaeⅢ位点插入了一小段大肠杆菌DNA，引入α互补筛选。

（3）M13载体系列

①M13载体系列的命名：

M13mpn，n代表系列数字。

②对M13mp1的改进：

加上常用的酶切位点。

如B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点，构建成M13mp2。

③对M13mp2的进一步改进产生了M13mp系列载体。

在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。

如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分别对应于pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

（4）M13mpl8和M13mpl9

M13mpl8和M13mpl9这两个载体含有13个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。

M13mpl8和M13mpl9DNA的全序列已经测定完成，这两种载体只是在lacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。

当RFDNA被两种不同的限制酶切割以后，M13mpl8和M13mpl9轻易不能重新环化。

仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。

这一片段在M13mpl8和M13mpl9中将以两个互为相反的方向插入。

这样一来，在M13mpl8的正链中含有外源DNA双链的其中一条链，而在M13mpl9正链中则含有外源DNA的另一条链，即M13mpl8重组体的子代噬菌体内含有外源DNA的一条链，M13mpl9重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。

故用M13mpl8和M13mpl9作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入DNA片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。

4.M13系列载体的优点

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。

（2）Xgal显色反应，可供直接选择。

（3）无包装限制，克隆能力大。

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。

5.M13载体的缺点

①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。

②实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。

图4-12M13mp18/19

6．M13噬菌体载体的宿主菌

由于M13噬菌体通过F质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。

Messing及其同事已经构建了许多携带F'

质粒并便于M13载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有：

（1）lacZDMl5lacZ基因缺失突变体。

（2）D（lac-proAB）lac基因缺失突变体。

（3）lacIqlacI基因的突变体。

（4）proAB细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。

（5）traD36抑制F'

因子接合转移的突变。

（6）hsdRl7与hsdR4对大肠杆菌K株Ⅰ类限制-修饰系统失去限制活性但仍保留修饰功能的突变体。

（7）recA1大肠杆菌重组酶基因。

（8）supE琥珀抑制基因。

在M13噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。

JM101supED（lac-proAB）[F'

traD36proAB+lacIqlacZDM15]

JM105JM101/hsdR4

JM107JM101/hsdR17

JM109JM101/hsdR17recA1

TG1JM101/hsdD5（不修饰不限制）

XL1-BluesupElac-hsdR17recA1[F'

proAB+lacIqlacZDM15]Tn10（Tetr）

四、噬菌粒载体（phagemidvectors）

噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。

此间隔区含噬菌体DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。

含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因Ⅱ蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA并进行包装。

克隆于这些载体内的外源DNA区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。

而带有这种质粒的细菌被M13（或f1）丝状噬菌体感染后，在病毒的基因Ⅱ蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。

基因Ⅱ产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。

常用的如pUC118/pUC119。

由带有M13复制起点的M13的基因间隔区（IG）和pUC18/pUC19质粒载体的质粒复制起点、Ampr、lacZ’、MCS等构成。

pUC118和pUC119是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源DNA片段的大小不那么敏感，并且保留了pUC质粒在克隆操作方面的优点。

在pUC18/19中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列（IG），当含这些质粒的细胞被适当的M13丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA的其中一条链，并包装在子代噬菌体颗粒中。

通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链DNA，用于DNA序列测定、定点诱变或制备探针。

pUC118/pUC119有两种不同的复制模式：

1）双链质粒复制模式，受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。

2）单链滚环噬菌体复制模式，来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。

噬菌粒具有以下特征：

①双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；

②免却了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；

③由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链；

④两种复制形式：

既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。

因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源DNA的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源DNA区段常常由于太大而不能克隆于常规M13载体。

但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且重复性较差。

图4-13Puc118/119

五、M13KO7辅助噬菌体 

M13KO7辅助噬菌体是M13的衍生株，大小为8.7kb。

M13KO7噬菌体带有来自p15A质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带ColE1的质粒共存于同一个宿主菌中。

还带有一个来自转座子Tn903的卡那霉素抗性基因（kanr），用作选择标记。

基因Ⅱ带有一个G至T的突变（第6125核苷酸），导致基因Ⅱ蛋白第40位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。

当M13KO7感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如E.coli（pUC118），进入宿主细胞内的单链DNA，在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒p15A的复制起点控制下进行复制。

由于细胞内M13K07双链DNA的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的M13K07病毒基因组的早期复制。

M13KO7基因组双链DNA可表达产生子代单链DNA所必需的所有蛋白。

但M13K07中突变的基因Ⅱ产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链DNA能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA能够占据优势。

六、PCR产物克隆载体---T载体

1．pCR系列载体

是Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。

由pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性构成。

突出特点是MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。

因PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。

图4-14pCR2.1的MCS

2．Promega公司的T载体系列

如pGEM-Tvector

图4-15pCR1

图4-16pTargetvector，G418抗性。

可在真核生物表达。

M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。

这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性：

　　第一，单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。

这种复制形式的DNA（replicationformDNA，简称RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。

　　第二，不论是RFDNA还是ssDNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。

　　第三，单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的。

因此对它们来说，并不存在包装限制的问题。

　　第四，应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。

　　第五，可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。

这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定，也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。

　　下面以M13噬菌体为例子加以说明。

　一．M13噬菌体的生物学特性

　　M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（十）链的DNA，有时亦称为感染性的单链（图5-11）。

　　M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端（图5-12）。

噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的

（一）链DNA。

由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型DNA。

它按θ形式进行几轮复制之后，基因Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。

这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。

其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3

（一）DNA为模板合成M13（＋）DNA。

当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的M13基因组DNA（图5-13）。

　二．M13克隆体系

（1）β-半乳糖苷酶显色反应原理

　　M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分，只有将两者结合在一起时，才能形成有功能的β-半乳糖苷酶，而且这种酶的活性还可以用Xgal显色反应法测定出来。

　　所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

　　顺反子互补作用偶然也能够以多肽片段的形式出现。

M13克隆体系就是一个典型的例子。

lac缺失突变lacZ（△M15），简称M15基因（不要同M13噬菌体混淆），合成的是一种缺失了11～41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶（又称M1