微生物肥料实验用培养基技术条件NYT1114Word文档格式.docx
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5.5.2.3 对能利用无机氮源的微生物，其菌种保藏培养基中不宜使用有机氮源。
5.5.2.4 对营养缺陷型微生物，其菌种保藏培养基中必须含有该缺陷所需的物质。
5.5.2.5 对耐某种药物的微生物，其菌种保藏培养基中应含有一定浓度的该种药物。
6 要求
6.1 材料
6.1.1 用于配制培养基的化学试剂纯度至少为化学纯。
6.1.2 试剂出现颜色改变、沉淀、混浊、吸潮结块的现象时，不宜使用。
6.1.3 天然原材料应质量稳定，未发生霉变、生虫和变质。
6.1.4 琼脂凝固后应具有良好的透明度。
6.2 器皿
6.2.1 配制试剂所用的器皿应洁净。
6.2.2 盛装培养基的器皿应由对微生物无毒害并耐高温的材料制成。
6.2.3 材料需加热溶解时，可选用玻璃容器、搪瓷缸和不锈钢容器等，禁用铜制、铝制和铁制容器。
6.3 棉塞或硅胶塞
6.3.1 不应使用脱脂棉制作棉塞。
6.3.2 使用棉塞或硅胶塞时，将其长度的2/3塞入容器内。
要求松紧适当，紧贴管壁。
6.3.3 灭菌时，棉塞外要加包牛皮纸或耐高温透气塑料薄膜，以防止灭菌时棉塞受潮或进水。
6.4 培养基配制
6.4.1 材料称量
6.4.1.1 根据培养基配方，准确称取相应材料的量。
6.4.1.2 当配方中某种成分微量时，可预先将该成分配制成一定浓度的母液，然后按量加入。
母液须低温保存。
6.4.2 材料溶解
6.4.2.1 不溶于水的组分应在所需的溶剂中溶解后，再加入到培养基中。
6.4.2.2 非溶性组分，如CaCO3,应最后加入。
6.4.2.3 易形成沉淀的组分应分别溶解。
6.4.2.4 不易溶解的组分应做预处理。
加热溶解过程中一旦出现焦化现象时应弃用。
6.4.2.5 培养基中含有指示剂或有颜色的试剂时，应在培养基pH调节好之后再加入。
6.4.3 pH测定与调节
6.4.3.1 用精密pH试纸或酸度计测定培养基的pH。
6.4.3.2 培养基的pH用稀酸或稀碱溶液调节。
调节过程中不可用酸碱溶液反复调节。
6.4.4 分装
装入三角瓶的培养基体积不应超过其容量的1/2，装入试管的培养基体积为其容量的1/4～1/5。
分装过程中防止培养基粘附在瓶口或管口。
6.4.5 灭菌
6.4.5.1 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌控制的条件为121℃、维持30min。
当培养基中含有不耐高温的组分时，可采用115℃、维持15min～30min。
6.4.5.2 过滤除菌
在无菌条件下，将待除菌溶液经滤膜为φ≦0.2μm的细菌过滤器，达到除菌的目的。
适用于易受高温破坏、失活的物质的灭菌，如维生素。
6.4.5.3 干热灭菌
将待灭菌的器皿，用纸包好或放在特定的容器内，置于烘箱中，在160℃左右保持2h。
适用于培养皿等玻璃器皿的灭菌。
6.4.6 平板和斜面的制备
在无菌条件下把冷却至45℃左右的培养基倒入无菌培养皿内，平板厚度范围控制在3mm～5mm。
制备的斜面长度不超过试管长度的2/5。
6.5 培养基合格检验
6.5.1 检查固体培养基湿度。
培养基冷凝水过多或干燥出现裂痕时，均不能使用。
6.5.2 随机抽取已灭过菌的培养基放入28℃～30℃培养箱中培养24h～48h，确定无菌生长后方可使用。
6.6 培养基存放
培养基应放在冰箱4℃～8℃保存。
经过存放的培养基使用前应进行6.5的合格检验，合格后方可使用。
7 微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途
微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途参见附录A。
附 录 A
（规范性附录）
常用培养基配方
A.1 营养琼脂
A.1.1 成分
蛋白胨
10.0g
牛肉膏
3.0g
氯化钠（NaCl）
5.0g
琼脂
18.0g
蒸馏水
1000mL
pH
7.2～7.5
A.1.2 配制要点
将各种成分溶解于蒸馏水内，调节pH，再加琼脂，加热溶化后分装。
121℃高压灭菌30min。
A.1.3 用途
适用于一般细菌培养和保藏。
A.2 芽孢杆菌培养基
A.2.1 成分
土壤浸出液
250mL
750mL
18.0g
A.2.2 配制要点
土壤浸取液：
土壤50g，加水200mL，121℃灭菌1h，过滤补水至250mL。
其他同A.1.2
A.2.3 用途
适用于芽孢杆菌的保藏。
A.3 阿须贝氏（Ashby）培养基
A.3.1 成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）
0.2g
硫酸镁（MgSO4·
7H2O）
碳酸钙（CaCO3）
甘露醇（C6H14O6）
硫酸钙（CaSO4·
2H2O）
0.1g
6.8～7.0
A.3.2 配制要点
同A.1.2
A.3.3 用途
用于固氮菌的培养。
A.4 根瘤菌培养基YM
A.4.1 成分
磷酸氢二钾（K2HPO4·
3H2O）
0.5g
酵母膏
1.0g
0.5%刚果红溶液
5mL
A.4.2 配制要点
将各种营养成分溶解于蒸馏水内，调节pH后，加入刚果红溶液。
再加琼脂，加热溶化后分装。
A.4.3 用途
适用于根瘤菌的培养。
A.5 根瘤菌培养基=2\*ROMANII
A.5.1 成分
酵母粉
200mL
15.0g
800mL
7.2
A.5.2 配制要点
土壤浸出液：
土壤50g，加水200mL，121℃灭菌1h，过滤补水至200mL。
A.5.3 用途
适用于根瘤菌的保藏和培养。
A.6 硅酸盐细菌培养基
A.6.1 成分
蔗糖（C12H22O11）
磷酸氢二钠（Na2HPO4·
12H2O）
2.0g
0.1g
三氯化铁（FeCl3·
6H2O）
0.005g
7.5～8.0
A.6.2 配制要点
先将三氯化铁配制成5‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2
A.6.3 用途
适用于硅酸盐细菌的培养。
A.7 固氮（茎瘤）根瘤菌培养基
A.7.1 成分
乳酸钠（C3H5O3Na）
1.67g
0.87g
0.05g
氯化钙（CaCl2）
0.04g
0.004g
18.0g
A.7.2 配制要点
先将三氯化铁配制成4‰的溶液按量加入，其他同A.1.2。
A.7.3 用途
适用于茎瘤根瘤菌的培养。
A.8 马丁培养基
A.8.1 成分
葡萄糖（C6H12O6·
H2O）
1%孟加拉红水溶液
3.3mL
氯霉素
A.8.2 配制要点
将营养成分用蒸馏水溶解后，按量加入1%孟加拉红水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培养基中。
115℃高压灭菌20min。
A.8.3 用途
适用于真菌的培养。
A.9 高氏合成一号琼脂
A.9.1 成分
硝酸钾（KNO3）
硫酸亚铁（FeSO4·
0.01g
可溶性淀粉（C6H10O5）n
20.0g
重铬酸钾（K2Cr2O7）
1000mL
7.2～7.4
A.9.2 配制要点
淀粉用少量冷水调成糊状,加热溶解后加入。
再加琼脂，加热溶化后分装，121℃高压灭菌30min。
重铬酸钾配制成溶液单独灭菌，使用时再加入到培养基中。
A.9.3 用途
适用于放线菌的培养。
A.10 联合固氮菌培养基
A.10.1 成分
D-葡萄糖酸钠（C6H10NaO7）
0.4g
0.02g
钼酸钠（Na2MoO4）
0.002g
A.10.2 配制要点
将氯化钙配、钼酸钠分别配制成2‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2。
A.10.3 用途
适用于固氮螺菌的培养。
A.11 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
A.11.1 成分
马铃薯
200g
A.11.2 配制要点
称取去皮马铃薯200g切块，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤取汁，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1000mL，115℃灭菌20min。
A.11.3 用途
适用于酵母菌的培养。
A.12 麦芽汁琼脂
A.12.1 成分
12波林麦芽汁（Brix）
5.4
A.12.2 配制要点
将麦芽汁调至12波林的糖度，调节pH，加入琼脂，加热溶化后分装。
A.12.3 用途
适用于酵母菌的培养和保藏。
A.13 乳酸细菌培养基（MRS）
A.13.1 成分
柠檬酸氢二铵[（NH4）2C6H6O7]
吐温80
乙酸钠（CH3COONa·
0.58g
硫酸锰（MnSO4·
0.25g
6.2～6.6
A.13.2 配制要点
121℃高压灭菌20min。
A.13.3 用途
适用于乳酸菌的培养。
A.14 光合细菌培养基=1\*ROMANI
A.14.1 成分
0.3g
A.14.2 配制要点
同A.1.2。
A.14.3 用途
适用于光合细菌的培养。
A.15 光合细菌培养基=2\*ROMANII
A.15.1 成分；
溶液=1\*ROMANI
75mg
乙酸钠（CH3COONa）
1.6g
烟酸
40mg
1.5g
生物素
硫胺素
氯化镁（MgCl2）
200mg
乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）溶液
微量元素溶液
1mL
800mL
溶液=2\*ROMANII
600mg
1.18g
将溶液=1\*ROMANI、溶液=2\*ROMANII分别于121℃高压灭菌15min，冷却后将溶液=1\*ROMANI、溶液=2\*ROMANII混匀。
微量元素溶液：
乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8·
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