1 范围
本标准规定了微生物肥料实验室使用地培养基技术要求.
本标准适用于微生物肥料产品质量检验、菌种培养与保藏用培养基地制备.
2 规范性引用文件
下列文件中地条款通过本标准地引用而成为本标准地条款.凡是注日期地引用文件,其随后所有地修改单<不包括勘误地内容）或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议地各方研究是否可使用这些文件地最新版本.凡是不注日期地引用文件,其最新版本适用于本标准.b5E2RGbCAP
GB/T19524.1-2004 肥料中粪大肠菌群地测定
NY527-2002 光合细菌菌剂
3 术语和定义
培养基medium
由人工配制地适合微生物生长、代谢、繁殖和保存地营养基质.
4 培养基制备流程图<略）
5 培养基选用原则
5.1 含有满足所培养地微生物生长必需地营养物质.
5.2 各种营养物质要有合适地比例和浓度.
5.3 有合适地pH范围和一定地缓冲pH能力.
5.4 有一定地氧化还原电位和合适地渗透压.
5.5 对于特殊用途地培养基,除遵循以上原则外,还应满足以下要求：
5.5.1 在选择培养基中,应加入利于目地微生物生长而抑制其它微生物生长地化学物质.
5.5.2 菌种保藏培养基选用原则
5.5.2.1 对于产芽孢或孢子地菌种保藏培养基应以易产生芽孢或孢子为原则.
5.5.2.2 对于自养微生物地菌种保藏培养基应只使用无机盐类,不使用有机物.
5.5.2.3 对能利用无机氮源地微生物,其菌种保藏培养基中不宜使用有机氮源.
5.5.2.4 对营养缺陷型微生物,其菌种保藏培养基中必须含有该缺陷所需地物质.
5.5.2.5 对耐某种药物地微生物,其菌种保藏培养基中应含有一定浓度地该种药物.
6 要求
6.1 材料
6.1.1 用于配制培养基地化学试剂纯度至少为化学纯.
6.1.2 试剂出现颜色改变、沉淀、混浊、吸潮结块地现象时,不宜使用.
6.1.3 天然原材料应质量稳定,未发生霉变、生虫和变质.
6.1.4 琼脂凝固后应具有良好地透明度.
6.2 器皿
6.2.1 配制试剂所用地器皿应洁净.
6.2.2 盛装培养基地器皿应由对微生物无毒害并耐高温地材料制成.
6.2.3 材料需加热溶解时,可选用玻璃容器、搪瓷缸和不锈钢容器等,禁用铜制、铝制和铁制容器.
6.3 棉塞或硅胶塞
6.3.1 不应使用脱脂棉制作棉塞.
6.3.2 使用棉塞或硅胶塞时,将其长度地2/3塞入容器内.要求松紧适当,紧贴管壁.
6.3.3 灭菌时,棉塞外要加包牛皮纸或耐高温透气塑料薄膜,以防止灭菌时棉塞受潮或进水.
6.4 培养基配制
6.4.1 材料称量
6.4.1.1 根据培养基配方,准确称取相应材料地量.
6.4.1.2 当配方中某种成分微量时,可预先将该成分配制成一定浓度地母液,然后按量加入.母液须低温保存.p1EanqFDPw
6.4.2 材料溶解
6.4.2.1 不溶于水地组分应在所需地溶剂中溶解后,再加入到培养基中.
6.4.2.2 非溶性组分,如CaCO3,应最后加入.
6.4.2.3 易形成沉淀地组分应分别溶解.
6.4.2.4 不易溶解地组分应做预处理.加热溶解过程中一旦出现焦化现象时应弃用.
6.4.2.5 培养基中含有指示剂或有颜色地试剂时,应在培养基pH调节好之后再加入.
6.4.3 pH测定与调节
6.4.3.1 用精密pH试纸或酸度计测定培养基地pH.
6.4.3.2 培养基地pH用稀酸或稀碱溶液调节.调节过程中不可用酸碱溶液反复调节.
6.4.4 分装
装入三角瓶地培养基体积不应超过其容量地1/2,装入试管地培养基体积为其容量地1/4～1/5.分装过程中防止培养基粘附在瓶口或管口.DXDiTa9E3d
6.4.5 灭菌
6.4.5.1 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌控制地条件为121℃、维持30min.当培养基中含有不耐高温地组分时,可采用115℃、维持15min～30min.RTCrpUDGiT
6.4.5.2 过滤除菌
在无菌条件下,将待除菌溶液经滤膜为φ≦0.2μm地细菌过滤器,达到除菌地目地.适用于易受高温破坏、失活地物质地灭菌,如维生素.5PCzVD7HxA
6.4.5.3 干热灭菌
将待灭菌地器皿,用纸包好或放在特定地容器内,置于烘箱中,在160℃左右保持2h.适用于培养皿等玻璃器皿地灭菌.jLBHrnAILg
6.4.6 平板和斜面地制备
在无菌条件下把冷却至45℃左右地培养基倒入无菌培养皿内,平板厚度范围控制在3mm～5mm.制备地斜面长度不超过试管长度地2/5.xHAQX74J0X
6.5 培养基合格检验
6.5.1 检查固体培养基湿度.培养基冷凝水过多或干燥出现裂痕时,均不能使用.
6.5.2 随机抽取已灭过菌地培养基放入28℃～30℃培养箱中培养24h～48h,确定无菌生长后方可使用.LDAYtRyKfE
6.6 培养基存放
培养基应放在冰箱4℃～8℃保存.经过存放地培养基使用前应进行6.5地合格检验,合格后方可使用.
7 微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途
微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途参见附录A.
附 录 A
<规范性附录）
常用培养基配方
A.1 营养琼脂
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 3.0g
氯化钠（NaCl> 5.0g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 7.2～7.5Zzz6ZB2Ltk
A.1.2 配制要点
将各种成分溶解于蒸馏水内,调节pH,再加琼脂,加热溶化后分装.121℃高压灭菌30min.
A.1.3 用途
适用于一般细菌培养和保藏.
A.2 芽孢杆菌培养基
A.2.1 成分
蛋白胨 5.0g
牛肉膏 3.0g
土壤浸出液 250mL
蒸馏水 750mL
琼脂 18.0g
A.2.2 配制要点
土壤浸取液：
土壤50g,加水200mL,121℃灭菌1h,过滤补水至250mL.
其他同A.1.2
A.2.3 用途
适用于芽孢杆菌地保藏.
A.3 阿须贝氏A.3.1 成分
磷酸二氢钾（KH2PO4> 0.2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.2g
氯化钠（NaCl> 0.2g
碳酸钙（CaCO3> 5.0g
甘露醇（C6H14O6> 10.0g
硫酸钙（CaSO4·2H2O> 0.1g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 6.8～7.0dvzfvkwMI1
A.3.2 配制要点
同A.1.2
A.3.3 用途
用于固氮菌地培养.
A.4 根瘤菌培养基YM
A.4.1 成分
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O> 0.5g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.2g
氯化钠（NaCl> 0.1g
甘露醇（C6H14O6> 10.0g
酵母膏 1.0g
0.5%刚果红溶液 5mL
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 6.8～7.0rqyn14ZNXI
A.4.2 配制要点
将各种营养成分溶解于蒸馏水内,调节pH后,加入刚果红溶液.再加琼脂,加热溶化后分装.121℃高压灭菌30min.EmxvxOtOco
A.4.3 用途
适用于根瘤菌地培养.
A.5 根瘤菌培养基=2\*ROMANII
A.5.1 成分
酵母粉 1.0g
甘露醇（C6H14O6> 10.0g
土壤浸出液 200mL
琼脂 15.0g
蒸馏水 800mL
pH 7.2
A.5.2 配制要点
土壤浸出液：
土壤50g,加水200mL,121℃灭菌1h,过滤补水至200mL.
其他同A.1.2
A.5.3 用途
适用于根瘤菌地保藏和培养.
A.6 硅酸盐细菌培养基
A.6.1 成分
蔗糖磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O> 2.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.5g
碳酸钙（CaCO3> 0.1g
三氯化铁（FeCl3·6H2O> 0.005g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 7.5～8.0SixE2yXPq5
A.6.2 配制要点
先将三氯化铁配制成5‰地溶液,按量加入,其他同A.1.2
A.6.3 用途
适用于硅酸盐细菌地培养.
A.7 固氮<茎瘤）根瘤菌培养基
A.7.1 成分
乳酸钠磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O> 1.67g
磷酸二氢钾（KH2PO4> 0.87g
氯化钠（NaCl> 0.05g
氯化钙（CaCl2> 0.04g
三氯化铁（FeCl3·6H2O> 0.004g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.1g
酵母膏 1.0g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 6.8～7.06ewMyirQFL
A.7.2 配制要点
先将三氯化铁配制成4‰地溶液按量加入,其他同A.1.2.
A.7.3 用途
适用于茎瘤根瘤菌地培养.
A.8 马丁培养基
A.8.1 成分
磷酸二氢钾（KH2PO4> 1.0g
葡萄糖（C6H12O6·H2O> 10.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.5g
蛋白胨 5.0g
1%孟加拉红水溶液 3.3mL
氯霉素 0.1g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
A.8.2 配制要点
将营养成分用蒸馏水溶解后,按量加入1%孟加拉红水溶液,氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培养基中.再加琼脂,加热溶化后分装.115℃高压灭菌20min.kavU42VRUs
A.8.3 用途
适用于真菌地培养.
A.9 高氏合成一号琼脂
A.9.1 成分
硝酸钾（KNO3> 1.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O> 0.5g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.5g
氯化钠（NaCl> 0.5g
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O> 0.01g
可溶性淀粉（C6H10O5>n 20.0g
重铬酸钾琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 7.2～7.4y6v3ALoS89
A.9.2 配制要点
淀粉用少量冷水调成糊状,加热溶解后加入.再加琼脂,加热溶化后分装,121℃高压灭菌30min.重铬酸钾配制成溶液单独灭菌,使用时再加入到培养基中.M2ub6vSTnP
A.9.3 用途
适用于放线菌地培养.
A.10 联合固氮菌培养基
A.10.1 成分
D-葡萄糖酸钠（C6H10NaO7> 5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4> 0.4g
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O> 0.1g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.2g
酵母膏 1.0g
氯化钠（NaCl> 0.1g
氯化钙（CaCl2> 0.02g
三氯化铁（FeCl3·6H2O> 0.01g
钼酸钠琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 6.8～7.00YujCfmUCw
A.10.2 配制要点
将氯化钙配、钼酸钠分别配制成2‰地溶液,按量加入,其他同A.1.2.
A.10.3 用途
适用于固氮螺菌地培养.
A.11 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
A.11.1 成分
马铃薯 200g
葡萄糖（C6H12O6·H2O> 20.0g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
A.11.2 配制要点
称取去皮马铃薯200g切块,放入水中煮沸30min,然后用双层纱布过滤取汁,再加葡萄糖和琼脂,溶化后补足水至1000mL,115℃灭菌20min.eUts8ZQVRd
A.11.3 用途
适用于酵母菌地培养.
A.12 麦芽汁琼脂
A.12.1 成分
12波林麦芽汁琼脂 18.0g
pH 5.4
A.12.2 配制要点
将麦芽汁调至12波林地糖度,调节pH,加入琼脂,加热溶化后分装.115℃高压灭菌20min.
A.12.3 用途
适用于酵母菌地培养和保藏.
A.13 乳酸细菌培养基A.13.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 10.0g
酵母膏 5.0g
柠檬酸氢二铵[（NH4>2C6H6O7] 2.0g
葡萄糖（C6H12O6·H2O> 20.0g
吐温80 1.0g
乙酸钠磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O> 2.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.58g
硫酸锰（MnSO4·H2O> 0.25g
琼脂 18.0g
蒸馏水 1000mL
pH 6.2～6.6sQsAEJkW5T
A.13.2 配制要点
将各种成分溶解于蒸馏水内,调节pH,再加琼脂,加热溶化后分装.121℃高压灭菌20min.
A.13.3 用途
适用于乳酸菌地培养.
A.14 光合细菌培养基=1\*ROMANI
A.14.1 成分
酵母粉 3.0g
蛋白胨 3.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O> 0.5g
氯化钙蒸馏水 1000mL
pH 6.8～7.0GMsIasNXkA
A.14.2 配制要点
同A.1.2.
A.14.3 用途
适用于光合细菌地培养.
A.15 光合细菌培养基=2\*ROMANII
A.15.1 成分；
溶液=1\*ROMANI
氯化钙乙酸钠烟酸 40mg
氯化钠（NaCl> 1.5g
生物素 40mg
酵母膏 2.0g
硫胺素 40mg
氯化镁（MgCl2> 200mg
乙二胺四乙酸铁微量元素溶液 1mL
蒸馏水 800mL
溶液=2\*ROMANII
磷酸二氢钾（KH2PO4> 600mg
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O>
升级会员 