《生化产品检测与》的实验讲解Word下载.docx

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这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；

二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点；

根据样液消耗量可计算出还原糖含量。

三．设备与耗材

水浴锅，容量瓶，三角烧瓶（250ml），柄皿（100ml），可调电炉，滴定管，移液管，漏斗

四．试剂

（1） 

斐林氏A液：

称15g五水硫酸铜和0.05g亚甲基蓝溶于水中转入1000ml容量瓶中并定容。

（2） 

斐林氏B液：

称50g酒石酸钾钠及75gNaOH溶入水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

（3）0.1%甲基红指示剂：

称取0.1g甲基红加60%的乙醇溶解并稀释至100ml放在滴瓶里待用。

（4）乙酸锌溶液：

称取21.9g乙酸锌加3ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml

（5）10.6%亚铁氰化钾溶液

（6）6MHCl：

量取50mlHCl加水稀释至100ml

（7）20%NaOH溶液

（8）1mg/mL葡萄糖标准溶液：

精密称取1.000g经过98-100℃干燥至恒重的葡萄糖，加水溶解后加入5ml盐酸并用水稀释定容至1000ml。

五．操作步骤

1．样品处理：

称取2.5g样品于50mL烧杯用100mL80℃的水分次溶解并倒入250mL容量瓶中，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌液和5mL亚铁氰化钾，摇匀后定容，静置半小时用干燥滤纸过滤，去初滤液，液备用。

2．糖水解后得样液：

吸取50mL滤液于250mL容量瓶中加5mL6MHCl在68-70℃水浴中保温15min，冷却后加1滴甲基红指示剂用20%NaOH溶液中和至中性，加水定容作为待测液。

3．标定费氏试剂：

吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度滴加至蓝色刚好褪去为终点，记录下来，平行三份。

计算出费氏试剂相当的葡萄糖含量（mg）。

4．样品溶液预测

吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2min内加热至沸→趁沸以先快后慢的速度滴加样液至蓝色变浅→以每秒一滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。

5．正式滴定：

吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，→加比预定量少1.0ml样液→2分钟内要求沸腾→趁沸以每秒一滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。

平行三次。

6．计算：

F：

与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数，

V1：

样品试液总体积

V2：

样品试液滴定量

W：

样品重量

7．思考题

（1）本法采用的澄清剂是什么，为什么不采用铜盐作为澄清剂？

（2）碱性酒石酸铜甲液和乙液为什么要分别贮存，用时才混合？

（3）滴定时为什么必须在沸腾条件下进行？

（4）样品溶液预测的目的是什么？

实验二苔黑酚法测定RNA的含量

一、原理

当RNA与苔黑酚（3，5-二羟基甲苯）在沸水中加热时，RNA被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它与苔黑酚在高铁离子的催化下可反应生成绿色复合物，后者在670nm处有最大吸收峰，在10～100μg/mL范围内其吸光度值与RNA浓度有线形关系。

二、试剂和器材

1.试剂

（1）标准RNA母液

准确称取RNA10.0mg，用少量水溶解（如不溶可滴加浓氨水，调pH7.0），定容至10mL，此溶液为1mg/mL。

（2）0.1mg/mL标准RNA溶液（配制10mL）；

（3）苔黑酚-三氯化铁试剂（临用时配配制）：

将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·

6H2O。

（4）10%硫酸溶液

（5）5%硝酸银溶液（配制50mL）

（6）0.2%氢氧化钠溶液（配制50mL）

此外还有干酵母粉，无水乙醇，氨水，无水乙醚（500mL，分析纯）2瓶，乙酸，氢氧化钠。

三氯乙酸，CuCl2·

H2O。

2.器材

可见分光光度计、恒温水浴锅

三、操作步骤

1．RNA的提取

称取8g干酵母粉于100烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液40mL，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。

冷却加入乙酸数滴使pH为5-6（用石蕊试纸试），离心10-15分钟（4000转/分钟）取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。

静置过滤，滤渣用乙醇洗2次，每次体积约10mL，继而用乙醚洗2次，每次体积约10mL。

乙醚滤干后，滤渣作为粗RNA，作鉴定和测定含量用。

2.鉴定

取上述RNA约0.5g，加10%硫酸溶液5mL，加热至沸1-2分钟，将RNA水解。

（1）吸水解液0.5mL，加苔黑酚-三氯化铁试剂1mL，加热至沸1分钟观察颜色变化；

（2）吸水解液2mL，加氨水2mL及5%硝酸银溶液1mL，观察是否产生絮状的嘌呤银化合物。

（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。

3.标准曲线的绘制

取12只试管分成6组，按下表操作。

取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

4．样品的测定

将一定量的RNA粗品用水溶解并定容，RNA浓度在10～100μg/mL范围内，取1.0mL样液于6号试管中，加水1.0mL及苔黑酚-三氯化铁试剂2.0mL，沸水浴保温45分钟，冷却测A。

根据标准曲线和稀释关系测的RNA的质量。

四.注意事项

样品蛋白质含量高时，应先用5％三氯乙酸沉淀蛋白质；

有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试剂中加适量的CuCl2·

H2O，可减少DNA的干扰。

五．思考题

鉴定中加入硝酸银的目的是什么?

实验三．气相色谱法测定食用酒中乙醇含量（内标法）

一　实验目的

1.了解气相色谱仪的基本结构；

2.学习和掌握使用氢火焰离子化检测器的基本操作；

3.掌握以内标法进行色谱定量分析的方法及特点；

4.学习气相色谱法测定乙醇含量的分析方法。

二、实验原理

气相色谱法是一种高效、快速而灵敏的分离分析技术。

当液体样品由进样口注入后立即被汽化，并被载气带入色谱柱，经过多次分配而得以分离的各个组分逐一流出色谱柱进入检测器，随时间变化而产生的电信号由记录仪得到气相色谱图。

对气相色谱图进行数学分析，即可对样品进行定性定量分析。

三、仪器与试剂

1.仪器：

气相色谱仪、氢火焰检测器（FID）、色谱柱、微量注射器、容量瓶（10cm3）、色谱工作站、吸量管（2、5cm3）。

2.试剂：

无水乙醇（A.R）、无水n-C3H7OH（A.R）、丙酮、食用酒。

四、实验步骤

1.色谱操作条件

柱温：

90℃；

汽化室温度：

150℃；

检测器温度：

130℃；

N2（载气）流速：

0.5cm3/min；

H2：

5542KPa；

空气：

42KPa；

2.标准溶液的测定

用吸量管准确吸取0.50cm3无水乙醇和0.50cm3无水n-C3H7OH于10cm3的容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀。

用微量注射器吸取0.5μL标准溶液，注入色谱仪内，记录各色谱峰的保留时间tR和色谱峰面积，求出以无水n-C3H7OH为标准物的相对校正因子。

3.样品溶液的测定

用吸管吸取1.00cm3的食用酒样品和0.50cm3的内标物（无水n-C3H7OH）于10cm3容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀。

用微量注射器吸取0.5μL样品溶液，注入色谱仪内，记录各色谱峰的保留时间tR，对照比较标准溶液与样品溶液的tR，以确定样品中的醇，记录C2H5OH和n-C3H7OH色谱峰面积，求出样品中C2H5OH的含量。

实验四生物传感器的制作及其葡萄糖浓度的测定（探索性实验）[参考贾仕儒编的《生物工程专业实验》244-248]

了解生物传感器的一般工作原理，掌握制作酶传感器和使用其测定葡萄糖浓度的方法。

二．实验原理

这时溶液中氧浓度的下降，相应的氧电极上的还原电流减少，通过电流值的变化可以确定葡萄糖的浓度。

三．实验设备与材料

（1）实验设备及仪器

电化学工作站、磁力搅拌器、pH计和超声波清洗器

（2）实验材料

葡萄糖氧化酶（Sigma公司，2000u/g），浓硫酸，丙酮，无水乙醇，葡萄糖（3

），硝酸纤维素膜（规格:

15X20cm孔径:

0.45μm 

），磷酸二氢钾（0.1M），磷酸氢二纳（0.1M）。

四．实验步骤

三电极体系：

酶膜修饰玻碳电极作工作电极，饱和甘汞电极（J6L）为参比电极，铂丝电极为对电极。

（1）工作电极的制作：

玻碳电极（GC）依次用1.0uma-氧化铝粉；

0.3uma-氧化铝粉；

0.05umg-氧化铝粉及麂皮抛光至呈镜面，再依次在水、无水乙醇和水中进行超声清洗，于红外灯下烘干备用。

在0.5mL，0.1M磷酸缓冲液（pH7，由磷酸二氢钾（0.1M）和磷酸氢二纳（0.1M）以1:

2的体积比混合制成）中加入1mg葡萄糖氧化酶。

溶解后加入一圆形，大小与玻碳电极的顶部尺寸相同为宜的硝酸纤维素膜进行酶的吸附半小时。

用镊子取出已固定好的酶膜，覆盖在GC顶部，注意两者之间不要有间隙或气泡。

再取大小适宜的硝酸纤维素膜作为保护层覆盖在酶膜外部，然后用固定环固定。

（2）采用三电极体系，利用I-t法测定标准溶液的电流值并绘制标准曲线

在恒电位550mV下，用5mLPBS缓冲液中注入连续滴加适量3

的葡萄糖时，得到恒定的安培响应

（3）测量未知浓度葡萄糖溶液的浓度

五．数据处理

六．思考题

如果所测样品的浓度超出标准曲线的直线范围，应如何处理？