LexA酵母双杂交系统简介Word文件下载.doc
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白
阴性对照
PlexA-X
没有直接激活活性
具有直接激活活性
菌落不能生长
酵母细胞毒性
4-1.
如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信号作用。
b能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2.
如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转化
SD固体培养基
LacZ表型
对照1
Gal/Raf/-His/-Ura
蓝
对照2
pLexA-53
Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu
＋pB42AD-T
实验
pLexA-X
待测
＋pB42AD-文库
5-1.
用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
-半乳糖苷酶无表达。
b5-2.
上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。
白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但
5-3.
同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：
AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。
由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4.
将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6.
阳性克隆的筛选
6-1.
随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2.
如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。
最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。
7.用质粒自然分选法（NaturalSegregation）筛除只含有AD-文库杂合子的克隆
7-1.
将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。
C孵育2-3天。
°
7-2.
将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30
7-3.
再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4.
将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。
8.
酵母杂合试验（YeastMating）确定真阳性克隆
如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
质粒1
（inYM4271）
质粒2
（inEGY48）
LacZ表型
Leu表型
pB42AD
不能生长
pLexA-靶DNA
pB42AD-文库
真阳性
pLexA-Lam
9.阳性克隆的进一步筛选和确证
9-1.
扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。
该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。
9-2.
将上述DNA电转化E.coliKC8宿主菌。
由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；
同时利用营养缺陷型筛选。
因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。
9-3.
用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。
9-4.
扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。
10.对双杂交系统阳性结果的进一步研究
10-1.
用不同的双杂交系统验证
10-1-1.
将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。
10-1-2.
选择不同的双杂交系统，如：
以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。
10-1-3.
将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。
-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。
b10-1-4.
去除或突变特定结合位点，定量检测
10-2.
用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。
10-3.
用其它的检测方法，如：
亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。
10-4.
进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系
构建于AD载体的cDNA文库的扩增
自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。
用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:
106和1:
108稀释。
lml加入90m3.
取稀释菌液各1090mm）；
37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。
fLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板（
确定待扩增的cDNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数×
108（1:
106稀释）或克隆数×
1010（1:
108稀释）。
按照>
150mm），共100块；
37℃倒置培养过夜。
f2-4×
104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板（
在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000mlLB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。
7.
留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。
其余培养菌液离心8000xg×
10min，4℃收集细菌；
用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。
LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15min
A.
bacto-Tryptone
10.0g
B.
bacto-YeastExtract
5.0g
C.
NaCl
D.
ddH2O→
1000ml
*LB固体培养平板为含有1.5%琼脂（Agar）LB培养基。
**LB/Amp培养基为含有Ampg/ml的LB培养基。
m50-100
构建于AD载体的cDNA文库的纯化
质粒DNA提取缓冲液
名称
缓冲液
配方
g/mlRNasemP1
悬浮缓冲液
50mMTris-HCl（pH8.0）；
10mMEDTA；
100A
P2
裂解缓冲液
200mMNaOH；
1%SDS
P3
中和缓冲液
3.0MKac（pH5.5）
QBT
平衡缓冲液
750mMNaCl；
50mMMOPS（pH7.0）；
15%异丙醇；
0.15%TritonX-100
QC
洗涤缓冲液
1.0MNaCl；
15%异丙醇
QF
洗脱缓冲液
1.25MNaCl；
50mMTris-HCl（pH8.5）；
培养菌液离心6000xg×
10min，4℃，每500ml培养物（下同）的沉淀重悬于50mlP1缓冲液。
加入50mlP2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min。
加入4℃预冷的50mlP3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min（其间再倒置混匀4-6次）。
将上述混合液再倒置混匀，离心12000xg×
30min，4℃，保留上清。
上清再离心12000xg×
15min，4℃，留上清。
将上清液上样于经35mlQBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。
以100mlQC缓冲液洗涤层析柱2次。
9.
以35mlQF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。
10.
以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg×
30min，4℃，小心去除上清。
11.
以7ml70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg×
10min，4℃，小心去除上清。
12.
将沉淀的质粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；
1/10体积3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃静置过夜。
13.
离心12500xg×
20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。
l），保存于-20℃。
mg/管（用于1次转化反应，约40m14.
干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200
构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞
将酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接种于5.0mlSD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>
1.0。
SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
DifcoNitrogen
0.67g
葡萄糖
2.00g
10×
DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）
10.0ml
20×
His
5.0ml
E.
Leu
F.
Trp
G.
100.0ml
将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
Polypepton
6.0g
3.0g
300ml
室温离心5000xg×
5min，弃上清；
加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×
TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
准备下列试剂
2×
转化反应
TE
LiAc
50%PEG
ddH2O
lml
/
120ml
15mA.
1×
TE/LiAc
0.15ml
15
l
/ml
960ml
120mB.
PEG/LiAc
1.20ml
120
900mC.
1.00ml
100
分装待转化的质粒DNA，振荡混匀。
lmg）
3-5mA.
pLexA-X（0.1
10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）
10
*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×
TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。
m6.
每管加入100
lm7.
各加入600PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
lm8.
各加入70DMSO缓和倒置混匀。
42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
室温离心13000xg×
10sec，尽量弃上清；
以0.3ml1×
TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His固体培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/-Ura，-His固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
1.34g
4.00g
20.0ml
Agar
ddH2O90-100mm）f→
200.0ml
铺8-10块平板（
附表1.不同规模转化酵母感受态细胞
SmallScale*
LargeScale
LibraryScale
转化反应
20
1
1
（1）
SD液体培养基扩增酵母菌
100ml
300ml
（2）
YPD液体培养基扩增酵母菌
300mla
1000mla
（3）
TE或ddH2O洗涤酵母细胞
15mlc
25-50mlb
500mla
（4）
准备A.1×
TE/LiAc缓冲液
1.5mld
1.0mld
8.0mlc
B.PEG/LiAc缓冲液
12.0mlc
6.0mlc
100.0mlb
C.1×
TE缓冲液
10.0mlc
10.0mlc
（5）
分装A.DNA-BDvectorgd×
0.2-1.0mgcm
0.1
gd
0.1-0.5mgmg×
10-50mB.ADvector
C.l
2.0mlml×
200mSpermDNA（10mg/ml）
TE/LiAc重悬感受态细胞
1.5mlc
1.0mlc
8.0mlb
l×
1.0ml
8.0mlm酵母感受态细胞
（7）
PEG/LiAc缓冲液
0.6ml×
6.0ml
60.0ml
7.0mlml×
700m
DMSO
70
（9）
室温离心后弃上清
13000xg×
10sec
2000xg×
5min
5min
（10）
TE重悬感受态细胞
0.3ml×
150mm×
50f150mm×
30
f90mm×
f铺固体选择培养基平板
注:
*即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”
**在不同容积的无菌离心管中进行，a:
300或500ml；
b:
50ml；
c:
15ml；
d:
1.5ml
文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞
以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。
将酵母宿主菌接种于5.0mlSD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura，-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>
SD/-Ura，-His液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
800ml
100mA.
4.8ml
600mB.
600
10.0ml
9.0ml
取1.0ml用1×
TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。
40mA.
pB42AD-Library（50-100
10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）
200
加入6.0mlPEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
加入700DMSO缓和倒置混匀。
室温离心2000xg×
5min，尽量弃上清。
以6.0ml100mm，每稀释度各×
2），30℃倒置培养3-5天，确定转化效率在2×
106cfu以上有效。
fl稀释不同倍数，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m1×
TE重悬沉淀细胞，取10
30），30℃倒置培养3-5天。
fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m11.
按每板200
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
13.40g
40.00g
200.0ml
ddH2O150mm）f→
2000.0ml
铺30块平板（
在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）缓冲液，将菌落刮下。
离心弃上清，加入10-20mlTE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，分装1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。
65%甘油-MgSO4缓冲液:
65%甘油；
100mMMgSO4；
25mMTris-HCl（pH8.0）
甘油
65.00ml
MgSO4•7H2O
2.465g
2.0MTris-HCl（pH8.0）
1.25ml
100.00ml
酵母双杂合系统阳性克隆的筛选
经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:
104、1:
108等不同浓度。
90mm），30℃倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。
fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m2.
取上述稀释菌液各100
确定待进一步鉴定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆数×
105（1:
104稀释）、克隆数×
107（1:
109（1:
按照以前实验确定的文库转化效率的
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