16SrDNA的提取鉴定.docx

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16SrDNA的提取鉴定

用16SrDNA方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1.掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；

2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、实验原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如（G+C）mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。

5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。

而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高.因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

利用16SrDNA鉴定细菌的技术路线：

PCR的基本原理：

必须已知部分序列设计出引物，10-30bp。

以此类推，呈几何级增长。

一般进行25-35个扩增循环

DNA可扩增106~109倍。

三、实验步骤

（一）细菌基因组DNA提取

技术路线：

具体步骤：

1.挑单菌落接种到10mL高氏液体培养基中37℃，振荡过夜培养。

（菌体培养）

2.取2mL培养液到2mLEppendorf管中，8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3.再往同一离心管中2mL培养液到2mLEppendorf管中，8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。

4.加入200μL缓冲液GA，充分悬浮、混匀，将菌体彻底悬浮。

5.再加入20μLProteinK，混匀，55℃温育10分钟。

（55℃为酶最适温度）

6.加入220μL缓冲液GB，混匀后，55℃温育10分钟。

（实为50-60℃之间）

7.加入220μL无水乙醇（降低体系粘稠度），充分混匀。

将上清（挑去其中絮状杂质，少部分，会产生气泡，除不去））小心转入UNIQ-10柱（羟基纤维素膜，特异吸附核酸，因为吸附有限，所以损失核酸）中。

13000rpm（离心机最高设定实为10000rpm）离心5分钟，倒弃收集管内的液体。

6.加入500μLGDSolution，10000rpm离心1分钟。

8.加入500μL70％乙醇（WashSolution），10000rpm离心0.5分钟。

（离心机最小设定实为1min，仪表盘上显示时间的梯形最小面积为1min，所以没法在到梯形面积中间时按暂停）

9.再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。

吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。

10.加入50μL预热（60℃）的洗脱缓冲液（TE，含RNase），加到柱子中间的膜上。

60℃放置5分钟。

12000rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。

11.电泳。

取5μL提取DNA溶液+2μLLoadingBuffer（不用吸放混匀，以免机械损伤DNA）进行电泳检测质量。

（吖啶橙做染色液，橙红色）

（二）PCR扩增

1.根据已发表的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。

16S（F）5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

16S（R）5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

2.PCR扩增体系：

在0.2mLEppendorf管中加入1μLDNA，再加入以下反应混合液：

16S（F）1μL（10μM）

16S（R）1μL（10μM）

2×PCRMix25μL（含10×PCRBuffer，dNTP，Taq酶）

ddH2O22μL（最先加）

反应体系50μL，简单离心混匀。

3.PCR反应

将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。

扩增条件为：

94℃3min

94℃30sec

50℃（实为52℃）45sec35cycles

72℃100sec（因为Taq酶1Kb/min,时间为经验所得）

72℃7min（充分延伸）

4.PCR产物的电泳检测

拿出Eppendorf管，取出全部溶液点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶大孔中。

电泳1hr。

在紫外灯下检测扩增结果（下午1:

50）。

（三）扩增片段的回收

根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。

否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。

1）称量一2mL.的Eppendorf管质量，记录0.99g。

2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2mL的Eppendorf管内，称量1,06g。

计算凝胶质量0.07g。

3）每100mg凝胶加入300μLBufferDE-A（促融），混匀。

70℃温育至凝胶融化。

4）加入0.5倍体积的BufferDE-B（帮助连接），混匀。

全部转入UNIQ-10柱（?

），10000rpm离心1分钟，倒去收集管（与之前的试剂盒中的收集管规格不同）内的液体。

5）加入500μLBufferW1（WashSolution），10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6）加入500μLBufferW2（去盐液，70%乙醇），10000rpm离心0.5分钟。

（离心机最小设定实为1min）

7）再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。

吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。

8）加入30μL预热的洗脱缓冲液（Eluent），60℃放置3分钟。

12000rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序

将回收的片段（足量）送至生物公司测序，测序引物为16SPCR引物。

（Sanger双脱氧法，一边PCR，一边测序）

四、实验结果及分析

1．细菌基因组提取DNA电泳结果：

第十一泳道为我组结果，条带清晰，说明提取的DNA含量较高。

2.PCR产物的电泳检测：

正极

点样孔为大孔，96μL。

Marker6条带，清晰明亮。

第五泳道为我组结果，可见条带清晰，说明提取的DNA含量较高。

3.根据测序结果，到NCBIBlast项目上进行比对，确定该未知菌的种属。

分析讨论实验的过程及结果。

选择序列三：

1）打开网站www.ncbi.nlm.nih.gov，选取BLAST。

2）选择核酸比对

3）将序列粘贴到框中，下面的方框选Referencegenomicsequence，按BLAST，得到结果。

序列三与葡萄球菌属细菌的16SrDNA基因相同性最高,与StaphylococcussaprophyticussubspATCC.的16SrDNA基因的相同性为99%。

可初步判定序列三所属菌株可能是Staphylococcus属的成员。

如果要明确的得到其种属，还要进行相关的生理生化分析。

（四）结果处理：

生成文件，制作进化树。

1）点击Rrna-16SribosomalRNA

进去后，按图示点击，CreateFiles,保存在文件夹中，供生成进化树时使用。

每一种保存一次，我们共对20组生成了文件，保存在一个文档中。

2）运行MEGA5.05软件，按如下操作，打开下载下来的Sequence文件。

4）点击Alignment,AlignbyClustalW，然后按OK键，等待。

5）得到以下画面，删除序列两端不能对齐的碱基（不同源）。

6）按Data,PhylogeneticAnalysis,关闭窗口，将文件保存。

7）选择一个方法，构建系统发育树。

8）Bootstrap选择1000，点击compute开始计算。

9）得到最终的进化树。

（我们用的是样品3，命名为Alice）

五、分析讨论

（一）

本次试验主要是通过16SrDNA的方法来鉴定细菌种属，通过提取基因组DNA、PCR扩增、电泳检测，最后将得到的序列在NCBI上比对，找出与之同源性最大的菌种，最后用MEGA4软件制作出进化树。

在做这个时要注意的地方：

1细菌基因组DNA的提取中，加入缓冲液GA后要彻底悬浮菌体，来回吸打几次，使菌体彻底悬浮，切记不要产生气泡。

2加完GB缓冲液后，手拿Eppendorf管轻轻地上下颠倒混匀，令其充分反应，破坏细胞膜。

加完无水乙醇后会看到澄清透亮的液体中有一团白色的残渣漂浮着，用枪头小心地把它挑出，避免抽入不溶性的絮状沉淀，否则后面会出现较多的粘稠状物质堵住膜孔

3离心前要精确平衡，避免对离心机造成机械损害

4预热的洗脱缓冲液要竖直打到硝酸纤维素膜上，该膜能特异性的吸附核酸，若打到壁上会造成损失

5提取好的基因组DNA要在4℃条件下保存

6在制作PCR扩增产物时，先加水，打DNA液时将枪头伸入水中，防止有DNA液损失在壁上。

其他的可以几个人一组制成大体系混合液，这样取用更加方便而且准确；

7取液时注意试剂瓶上的标志，如10×、6×等，用前记得稀释；

8割胶的时候要带手套，带好紫外线防护罩，防止伤害眼睛。

9通过查找资料，我们摸索出了在NCBI上进行序列比对以及构建进化树的方法，过程很艰辛，但结果令人欣慰。

10构建进化树时，一定要参考多和同学们讨论，有条件时多多向实验室的研究生学长学姐请教，他们经常会用到BLAST和MEGA软件，知道很多小技巧和注意事项，在做进化树的时候给我很大的帮助。

11

（二）

1．由于核糖体进化保守，所以可以通过测定核糖体16SrDNA（序列约1.5KB）来鉴定细菌种属。

若要鉴定真核生物，则测定核糖体18SrDNA。

2．氯仿抽提可以去除蛋白（中间层）和有机物，G+菌用溶菌酶，G-菌用细胞膜裂解液。

GA为Tris-Hcl，GB为裂解缓冲液SDS。

3．好引物的特点：

扩增产物多，杂带少。

4．由于分子生物学实验的特点是实验时间长，中间等待时间长，涉及的高值仪器多，接触有害试剂多，实验原理较复杂，所以我们要严格遵守实验室纪律，认真做好实验，认真做好值日，从有限的学时中真正地学到东西。