环境工程微生物实验指导.docx
《环境工程微生物实验指导.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《环境工程微生物实验指导.docx（18页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
环境工程微生物实验指导
环境工程微生物实验指导
实验一微生物形态观察
一、实验目的
1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。
2、巩固显微镜的使用方法。
3、学习微生物画图方法。
二、实验原理
1、细菌的基本形态
细菌是单细胞的微生物，能够独立进行生活，它的种类繁多，但基本形状有四种：
球状、杆状、螺旋状和丝状，分别称为：
球菌、杆菌、螺旋菌和丝状菌。
（1）球菌：
细胞呈球形或椭圆形，根据它们相互联结的形式可以分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。
如金黄色葡萄球菌。
球菌大小以直径表示，一般为0.5~1μm。
（2）杆菌：
细胞呈杆状或圆柱形，大小以宽度×长度表示，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。
如大肠杆菌就比较细而短、枯草杆菌粗而长。
杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。
（3）螺旋菌：
细胞呈弯曲杆状，螺旋菌细胞壁坚韧较硬，常以单细胞分散存在。
大小一般为（0.3~1.0）μm×（1.0~50）μm，根据其弯曲情况可分为弧菌、螺菌、螺旋体。
弧菌只有一弯曲，而螺菌有2~6个弯曲。
其大小为0.3~1×1~50μm。
若菌体弯曲螺旋圈数较多者，无坚韧的细胞壁，比较柔软，能自由运动，通称为螺旋体。
2、细菌的特殊构造
细菌细胞的特殊构造有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
（1）荚膜：
是有些细菌生活在一定营养条件下，向细胞壁表面分泌的一种粘液状、胶质状的物质。
用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体。
（2）鞭毛和菌毛：
鞭毛是某些微生物细胞表面着生的一根或数根细长、波曲、毛发状的丝状物。
直径为0.1~0.2μm，它是细菌的运动器官。
在光学显微镜下不能直接观察到。
经过特殊的鞭毛染色后，在光学显微镜下可以看到鞭毛。
（3）芽孢：
是某些细菌在其生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形、壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。
芽孢形成的位置、形状、大小可因菌种而异。
如：
枯草芽孢杆菌的芽胞位于菌体中间，呈卵圆形比菌体小；破伤风梭菌芽胞位于菌体一端呈圆形，比菌体大，使菌呈棒锤形。
因此，能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊中的位置、大小等特征是细菌鉴定的依据之一。
3、真菌的特征结构
菌丝：
是真菌营养体的基本单位。
菌丝是一种管状的细丝，用显微镜观察，像一个透明的管，直径一般3~10μm，与酵母菌相似，比细菌和放线菌的细胞直径约粗几倍到几十倍。
根据菌丝中是否存在隔膜，可以把真菌菌丝分成两种类型：
有隔菌丝和无隔菌丝。
无隔菌丝中无隔膜，整个菌丝体就是一个细胞，其中含有多个细胞核，是低等真菌具有的菌丝类型。
有隔菌丝有隔膜，菌丝体由多个细胞组成，每个细胞有1个或多个细胞核，是高等真菌具有的菌丝类型。
4、放线菌的特征结构
放线菌是主要呈丝状生长、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。
放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞微生物。
在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1μm。
菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。
链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，如灰色链霉菌。
三、实验用品
1、器材
（1）普通光学显微镜
（2）细菌装片：
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、破伤风梭菌（3）真菌装片：
青霉、黑曲霉、产黄青霉（4）酵母菌装片：
出芽酵母、酿酒酵母（5）放线菌装片：
灰色链霉菌
2、试剂和材料
（1）擦镜纸，
（2）香波油，（3）二甲苯。
四、实验方法与步骤
1、细菌基本形态观察
（1）显微镜下观察细菌三型装片，金黄色葡萄球菌装片，注意菌体间的关系。
（2）显微镜下观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的装片。
（3）显微镜下观察螺旋菌装片，注意菌体的螺旋。
2、细菌特殊构造观察
（1）油镜下观察固氮菌装片：
注意观察荚膜的位置、形态以及与菌体的关系；注意荚膜与菌体的染色差异，染色后，菌体呈黑色，荚膜无色。
（2）油镜下观察大肠杆菌装片：
注意鞭毛的染色位置数目形状和大小。
（3）油镜下观察枯草芽孢杆菌及破伤风梭菌装片；注意芽孢和菌体染色的差别，芽孢的形态大小和位置。
3、真菌的特征结构观察
观察青霉、黑曲霉装片，注意观察它们的分生孢子形状，组成等。
4、酵母菌的形态观察
观察出芽酵母形状和出芽方式。
5、放线菌的形态观察
五、思考题
1、画一圆圈表示视野，选取一些有代表性的微生物画图，注意特殊构造形状和排列方式。
颜色深的可用点的密度来表示，不可涂抹，标注所观察的菌种名称，放大倍数和特殊结构。
2、细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的细胞大小细胞形态有何区别？
实验二微生物染色
一、实验目的
1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2、巩固显微镜的使用方法。
3、了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、实验原理
虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。
由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
1、细菌的简单染色法
所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，易于在显微镜下进行观察。
染色前必须先固定细菌。
其目的有二：
一是杀死细菌并使菌体黏附于载玻片上，二是增加菌体对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
2、革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要依据。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：
碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
三、实验用品
1、器材
（1）显微镜
（2）酒精灯（3）载玻片（4）接种环（5）双层瓶（6）擦镜纸（7）试管夹（8）二甲苯（9）香柏油（10）吸水纸（11）染色缸
2、试剂和材料
（1）吕氏碱性美蓝染色液，
（2）石炭酸复红染色液，（3）草酸铵结晶紫染色液
（4）路哥尔氏碘液，（5）95%乙醇，（6）复红染色液，（7）生理盐水，（8）菌种
四、实验方法与步骤
1、细菌的简单染色法
（1）涂片取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作，分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜（挑菌宜少，涂片要薄，过厚不易观察）。
注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
（2）干燥于室温下自然干燥。
（3）固定涂片面向上，于火焰上通过2~3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。
但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
（4）染色放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。
吕氏碱性美蓝染色液约染2~3分钟，石炭酸复红染色液约染1~2分钟。
（5）水洗染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。
注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。
冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。
（6）镜检置于显微镜下观察。
（7）清理 实验完毕，清洁显微镜和玻片。
2、革兰氏染色法
（1）涂片
将培养14~16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰2~3次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）染色
①初染加草酸铵结晶紫一滴，约1min，水洗。
②媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20~30秒钟，立即用水冲净酒精。
④复染用番红液染1~2min，水洗。
（3）镜检干燥后，置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（4）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
（5）清理 实验完毕，清洁显微镜和玻片。
五、思考题
1、绘出你所观察到的经单染的两种细菌形态图。
2、在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？
它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？
3、根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
4、制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
5、作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
其染色成败的关键一步是什么？
实验三微生物细胞计数
一、实验目的
1、明确血球计数板的构造及计数的原理。
2、学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理
如果要区分计数样品中的活菌和死菌，可以采用微生物的活体染色，然后计数。
微生物的活体染色就是采用对微生物无毒的染料（如美蓝、中性红等）配成一定的浓度，在与一定量的菌液混合，经过一段时间后，活菌和死菌会呈现不同的颜色，这样就可以在显微镜下区分活菌和死菌。
美蓝是常用的活体染色染料，它处于氧化态时呈蓝色，还原态时无色。
用美蓝进行活体染色时，由于活细胞代谢过程中的脱氢作用，美蓝接受氢后由氧化态变为还原态，因此活细胞无色，而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止，不能还原美蓝，因此细胞呈淡蓝色或蓝色。
三、实验用品
1、器材
（1）血球计数板
（2）显微镜（3）盖玻片（4）无菌毛细管（5）吸管（6）擦镜纸（7）吸水纸（8）三角瓶（9）玻璃珠（10）计数器
2、试剂和材料
（1）酿酒酵母斜面，
（2）95％酒精棉球，（3）生理盐水，（4）pH7磷酸盐缓冲液，（5）美蓝染色液
配方：
美蓝0.025g，NaCl0.9g，KCl0.042g，CaCl2·6H2O0.048g，NaHCO30.02g，葡萄糖1g，蒸馏水100mL
四、实验方法与步骤
1、计总菌数
（1）稀释
（2）镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗后才能进行计数。
先用自来水冲洗（切勿用刷子洗刷），再用95%的酒精棉球轻轻擦洗后用水冲洗，最后用吸水纸吸干（切勿在酒精灯上烘烤而导致计数板爆裂）。
镜检确认计数板清洁后方可使用。
盖玻片也作同样的清洁处理。
（3）加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用细口滴管将菌液来回吹吸数次，使菌液充分混匀并使滴管内壁吸附完全后，立即用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片与计数板边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
注意不可有气泡产生。
静置5~10分钟，待菌体自然沉降与稳定后，在显微镜下选择中格区计数。
（4）显微镜计数
将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。
若计数室有25个中方格，每个计数室选5个中格中的菌体进行计数，通常可选4个角和中央的中格。
若计数室有16个中方格，可选4个角的中方格进行计数。
位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
由于菌体细胞在血细胞计数板上处于不同的位置，因此观察时必须不断调整微调节器，改变显微镜焦距，才能计数全部菌体，以免遗漏。
（5）清洗血球计数板
使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。
镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。
若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
2、计活菌、死菌数
（1）制备酵母菌菌悬液
取在麦芽汁斜面培养基上的酿酒酵母１支，加入适量pH7磷酸盐缓冲液分2~3次将菌苔洗下来，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，充分振荡，使细胞分散。
该菌悬液进行适当稀释后作为计数的样品，菌液如不浓，可不必稀释。
为提高计数精度，菌液应稀释到计数板每个中格平均有15~20个细胞数。
（2）活体染色
取上述配制的美蓝染色液0.9mL于试管中，加入上述菌液0.1mL混合均匀，染色10分钟后进行计数。
（3）镜检计数室
方法同前。
（4）加样品（染色菌液）
方法同前。
（5）分别计数和计算
按照计数总菌数的方法分别计数活菌数（无色）和死菌数（蓝色）。
再计算出活细胞百分比。
（6）清洗血球计数板：
方法同前。
五、思考题
1、记录计数结果，取2次的平均值。
2、根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？
应如何尽量减少误差，力求准确？
3、在滴加菌液时，为什么要先置盖玻片，然后滴加菌液？
能否先加菌液，再置盖玻片？
4、为什么菌液一定要摇均匀，再加入计数板？
为什么计数室内不能有气泡？
实验四培养基的制备和灭菌
一、实验目的
1、了解微生物培养基的配制原理和培养基的种类。
2、掌握微生物培养基配制的一般方法和操作步骤。
3、了解各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。
另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。
三、实验用品
1、器材
（1）漏斗
（2）分装架（3）三角瓶（4）试管（5）移液管及移液管筒（6）量筒（7）精密pH试纸（8）牛角匙（9）称量纸（10）培养皿（11）玻璃棒（12）烧杯（13）天平（14）试管架（15）铁丝筐（16）剪刀（17）酒精灯（18）棉花（19）线绳（20）牛皮纸或报纸（21）纱布（22）电炉（23）高压灭菌器（24）干燥箱
2、试剂和材料
（1）蛋白胨、可溶性淀粉、葡萄糖，
（2）牛肉膏、马铃薯、5%NaOH溶液、5%HCl溶液，（3）NaCl，（4）琼脂。
四、实验方法与步骤
1、培养基的制备
（1）称量药品
根据培养基配方与配量依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
（2）溶解
用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。
（3）调节pH
根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。
测定pH可用pH试纸或酸度计等。
（4）溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。
琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分。
注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
（5）过滤
若需配制出清澈透明的液体培养基，可用滤纸过滤。
（6）分装
①分装三角瓶
取配制好的液体培养基200mL分装于500mL三角瓶中，然后每瓶中加入琼脂粉4g（按2%计）。
此法可使融化琼脂和灭菌同步进行，以节省配制培养基时融化琼脂所需的时间。
三角瓶装量以不超过三角瓶容积的一半为宜，装量过多，灭菌时培养基在沸腾中易沾污棉塞及存放中易导致瓶内培养基的染菌等。
②分装试管
将融化的固体培养基趁热加入分装漏斗中。
分装时左手拿数只试管，右手控制弹簧夹，让培养基依次流入各试管。
液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。
（7）加棉塞
试管口和三角瓶口塞上棉花制作的棉塞。
（8）包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层牛皮纸，用棉绳系好，以防灭菌时冷凝水直接沾湿棉塞及存放中防止尘埃等污染。
在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
（9）灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。
普通培养基为121℃灭菌20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。
（10）倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45~50℃，立刻倒平板。
（11）搁斜面
培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则等培养基冷却至50~60℃后摆放成斜面。
搁置时将管口一端放在玻璃棒或其他高度适当的木棒上，调整斜面的倾斜度，以斜面长度一般不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂培养基。
（12）贮存
经无菌试验，证实培养基已经灭菌彻底后，收藏于冰箱中备用，存放期间尽量避免反复移位或晃动等易造成污染的行为。
2、灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。
简述如下：
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。
通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。
蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
（1）湿热灭菌
①煮沸消毒法：
注射器和解剖器械等均可采用此法。
先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。
对于细菌的营养体煮沸约15~30min，对于芽孢则需煮沸约1~2h。
②高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。
这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。
当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15~30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。
一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15~30min可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
灭菌后的培养基空白培养：
灭菌后的培养基放于37℃培养箱中，经24h培养后，如无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
（2）干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。
一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160~170℃维持1~2h。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。
凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
①灭菌前的准备
②干燥箱灭菌
③火焰灭菌
（3）过滤除菌
许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。
应用最广泛的过滤器有蔡氏（Seitz）过滤器和膜过滤器。
（4）紫外线灭菌
紫外线波长在200~300nm，具有杀菌作用，其中以265~266nm杀菌力最强。
无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌（一般为30min）。
在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。
紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。
另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2），O3和H2O2均有杀菌作用。
紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。
紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。
由于紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以，不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。
（5）化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。
实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。
常用的有2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3~5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。
五、思考题
1、制备培养基的一般程序是什么？
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？
3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
4、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
5．高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？
灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？
实验五水中细菌总数测定
一、实验目的
1、学习并掌握水样采集和水中细菌总数测定的方法。
2、了解水质状况与细菌数量在饮用水中的重要性。
二、实验原理
水中细菌总数可以作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
细菌数量越多，则水中有机质含量越高。
在水质卫生学检验中，细菌总数是指1mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中经37℃、24ｈ培养后所生长出的细菌菌落数。
我国规定1mL自来水中细菌总数不得超过100个。
本实验采用平板菌落计数法测定水中细菌总数。
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及水源的污染程度的检定等。
三、实验用品
1、器材
（1）无菌平皿
（2）1ml无菌吸管（3）试管架（4）记号笔（5）盛有9ml无菌水的试管（6）微量移液器（7）吸液头 （8）带玻璃塞的三角瓶 （9）恒温培养箱 （10）超净工作台 （11）酒精灯
2、试剂和材料
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂10~15g，蒸馏水1000mL，pH7.2
四、实验方法与步骤
1、水样采集和保藏
（1）自来水：
先将水龙头用火焰灼烧3min灭菌，然后再放水5~10min，最后用无菌容器接取水样，并迅速送回实验室检测（较清洁的水可在12h内测定）。
（2）池水、河水、湖水：
将无菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入距水面10~15cm的深层水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，当取完水样后，即将瓶塞塞好（注意：
采样瓶内水面和瓶
升级会员 