第三章软组织检验Parenchyma inspection.docx

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第三章软组织检验Parenchymainspection

第三章人体软组织的检验

Chapter3TheParenchymainspection

第一节概述（Summarize）

人体组织是重要的法医物证之一。

在凶杀、强奸、空难、纵火、斗殴、意外事故、交通肇事等现场，常遗留有组织、器官碎片等。

通过对各类人体组织的遗传标记分析，可以重建案件现场，为侦查线索提供，确定犯罪嫌疑人，为审判提供证据。

（Humantissueisoneofimportantforensicbiologicalevidence.Inthesceneofmurder,rape,crash,arson,assault,accidents,trafficaccidentscene,etc.,thereusuallyexistthetissueororganpieces.Throughtheanalysisofvariousgeneticmarkersofhumanbodytissue,therecomesthetrailtoreconstructcrimescene,providecluesfortheinvestigation,maketheconfirmationofsuspects,supplytheevidenceofadjudgement.）

人体组织的基本结构单位和功能单位是细胞。

根据法医物证检验的特点将人体组织分为软组织（parenchyma）（皮肤skin、肌肉muscle、脏器organ等）、硬组织（hardtissue）（骨骼bone、牙齿tooth）和角化组织（keratinizedtissue）（毛发hair、指甲fingernail、趾甲toenail等）。

法医物证鉴定可通过对人体组织遗传标记的测定而达到个人识别和亲子鉴定的目的。

人体组织只要没有腐败，就可以从中提取DNA进行鉴定。

（Oncetherehasnocorruptionofthehumantissue,wecanextractthetissueDNAforidentification.）

一.软组织检验（TheParenchymainspection）

（一）软组织的特性（Thecharacteristicsofparenchyma）

在交通肇事、碎尸、空难、爆炸等案件中，组织块是最常见的法医生物检材。

与其它法医生物检材一样，组织有其固有的形态结构特征，通过形态学、免疫学、免疫组织化学以及分子生物学方法确定组织块的种类、种属、性别以及身份来源。

（Throughthemorphology,immunology,immunohistochemistryandmolecularbiologymethodstodeterminetissuetype,species,gender,andidentitysources.）

1.软组织的形态结构（Themorphostructureofparenchyma）

组织经固定、切片、HE染色可辨别为何种组织，如皮肤组织有复层鳞状上皮细胞的表皮层结构，常附有真皮的毛囊和皮脂腺以及皮下脂肪组织。

有神经细胞及神经胶质细胞的是脑组织。

仅有浆液性腺泡的腺体为腮腺，有粘液性腺泡和浆液性腺泡混合结构者为颌下腺或舌下腺。

肝脏有肝细胞及胆管组成的肝小叶结构。

呈腺体细胞排列，其间有胰岛则为胰腺。

有粘膜层、粘膜下层、肌层、外膜四层结构则为消化道组织。

肾脏则有肾小球、肾小管结构。

通过对组织显微镜下形态结构的观察可确定为何种组织。

2.组织的ABH物质分布（TheABHdistributionofparenchyma）

ABH抗原不仅存在于人类红细胞上，也存在于人体各种上皮组织、血管与淋巴管的内皮细胞、心内膜及神经组织的神经细胞与触突等。

用吸收法、解离法、红细胞粘附试验以及酶标抗体免疫组织化学方法可对人体组织的ABH抗原物质进行测定。

3.各种因素对人体组织的影响（Variousfactorsontheimpactofhumantissues）

人体组织细胞中的溶酶体含有丰富的蛋白水解酶及核酸酶，组织细胞失去生理功能后，胞浆内溶酶体破裂，释放出各种酶使组织细胞的蛋白质、核酸水解。

特别是在潮湿、高温等理化因素的作用下，大量细菌、真菌生长，可以加速组织的自溶和腐败，使组织形态结构改变、破坏，ABH血型物质破坏、酶活性丧失、DNA降解。

4.不同组织遗传标记具有同一性（Differenttissueshavethesamegeneticmarkers）

正常情况下，同一个体不同组织的血型、酶型、DNA分型结果相同。

当组织发生癌变时，血型及DNA分型可能发生变化。

高度腐败的组织，由于大量微生物的繁殖可产生获得性B物质，同时发生DNA的降解，影响DNA的分析。

（二）软组织检验的目的与要求

（Thepurposesandrequirementsofparenchymainspection.）

组织作为重要的法医物证之一，检验的目的主要是进行个人识别和亲子鉴定，通过对案件现场组织的检验以解决个体的身份认定。

同其他法医生物检材的检验一样，组织的检验首先要确定是否是组织，是人体还是动物的组织，如果是人体组织，需要进行个人识别。

组织比其他生物检材更容易发生自溶和腐败。

在提取和送检组织材料时应注意（Duringtheextractionandinspectionoftheparenchyma,theremustbeconcerned）：

（1）尽快送检（Submissionassoonaspossible）

（2）组织检材不能及时送检时应低温保存或干燥处理，充分干燥后保存。

所有的组织检料不能用甲醛固定（Thetissuemustn’tbeformalinfixated,driedandstoredsufficientlywouldbethebestmethod.）

（3）不同组织中含蛋白酶量不同，自溶和腐败的速率有明显差异，例如肝脏、脾脏中核酸酶丰富，蛋白质、DNA降解较快，因此肝脏、脾脏一般不作为首要的取材部位。

肌肉组织，脑组织等是提取DNA的较理想的检材。

（Differenttissuehasdifferentdegradationrate,muscleandbrainistheidealsamplestoselectDNA.）

（三）确定是否是组织（Theconfirmationofthetissue）

发生碎尸、空难灾害事故时，组织块一般较大，肉眼就可以确定。

如果肉眼无法确定，可进行组织切片，进行HE染色，显微镜观察即可确定是否为组织及何种组织。

（四）种属鉴定（Speciesidentificationofthetissue）

1.免疫学方法（Immunologicalmethods）

用抗人血清与组织浸液做沉淀反应，凝集反应及酶免疫分析等。

一般用沉淀反应既简便又快捷。

2.分子生物学方法（Molecularbiologymethods）

人类的一些基因与动物不同，可用人类特异性DNA探针分子杂交技术，或用人类特有序列作引物用PCR扩增组织DNA，观察是否有特异性扩增产物。

具体有下面一些方法：

（1）根据Alu序列做种属鉴定；

（2）根椐28srRNA序列鉴定种属；

（3）根据SON基因3’非编码区序列鉴定种属；

（4）根据细胞色素b基因序列进行种属鉴定。

（五）性别鉴定（Genderidentification）

一些完整的组织，如子宫、前列腺、卵巢、睾丸等可以直接判定性别。

组织碎块的性别测定主要是用分子生物学方法。

目前成熟的方法是对Amelogenin基因的扩增检测。

（六）组织块的个人识别（Theindividualidentificationofparenchyma）

1.ABO血型测定（ABObloodtyping）

（1）吸收试验将组织剪成碎块做吸收试验，可测定被检组织的ABO血型。

（2）解离试验组织剪碎后用10%蛋清粘附于载玻片上，或将组织匀浆后粘附于纱布上，用粘附有组织的纱布纤维做解离试验。

由于是将组织研碎后进行检验，组织细胞与组织中的血管、血窦及血管腔中的红细胞已相互混合，因此检测时不会受到组织中ABH物质多少或分泌状态的影响。

对组织中ABH物质检测时限的研究表明：

空腔脏器的检出时限短于实质脏器。

肾、肠、食道等本身含有较多酶及一定量细菌，如胰腺本身就含有大量的胰蛋白酶。

由于酶和细菌的作用，血型抗原物质易被破坏。

（3）红细胞粘连试验组织块用甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，取切片三张，依次浸入二甲苯及乙醇中脱蜡，生理盐水洗涤，挥干后分别加抗-A，抗-B、抗-H血清覆盖切片组织，置保湿盒室温1h，用生理盐水振荡洗涤三次，加小牛血清防止发生指示红细胞非特异性粘附。

室温5min后直接按标记加相应1%指示红细胞1～2滴，置保湿盒室温反应30min，倾弃多余红细胞悬液，将组织贴面朝下，架于盛有生理盐水的塑料盒盖上，使盐水与组织接触，室温静置5min，显微镜下观察结果。

指示红细胞粘附于组织细胞者为阳性反应，未粘附者为阴性反应。

（4）免疫组化法取石蜡包埋组织切片三张，脱蜡后，生理盐水洗涤，浸入0.01mol/LPBS液（含3%H2O2，pH7.4）10min，灭活组织中内源性过氧化物酶，用生理盐水振荡二次，分别加单克隆抗-A、抗-B、抗-H抗体，37℃湿盒中反应1h，用生理盐水振荡洗涤三次，加辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体，置37℃湿盒中反应1h，用生理盐水振荡洗涤三次，浸入DNB底物溶液中反应5min，水洗，干燥后封片，显微镜下观察结果。

阳性结果可见组织细胞染成深褐色，阴性结果呈浅黄色或不着色。

（5）ABO基因分型提取组织DNA后可用PASA（PCRallele–specificamplification）法，扩增限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP），等位基因寡核苷酸探针杂交法（ASO-PCR）等方法测定组织的ABO基因型。

2.同工酶测定（Determinationofisozyme）

将人体组织制成匀浆，加样电泳，可测定PGM1，6PGD，ADA，AK，ESD，GLOI，DIA等酶型。

3.DNA分析（DNAanalysis）

新鲜组织块、蜡块组织切片中均能提供DNA模板用于DNA多态性分析。

（1）组织的DNA提取新鲜组织或冷冻组织，常规用有机法抽提，检材量少时直接用Chelex-100提取，提取液中需加入适量蛋白酶K，以保证组织被完全消化。

腐败组织一般都丧失了DNA分型检测的条件，尽可能地选择腐败较轻的组织，先用有机法抽提，待DNA沉淀后再用Chelex-100提取一次，以消除某些干扰PCR扩增的物质。

组织切片或蜡块，需用辛烷或二甲苯、无水乙醇脱蜡后按新鲜组织的提取方法提取DNA。

甲醛固定的组织块，蛋白质凝固变性，提取DNA比较困难，消化时需增加蛋白酶K的用量并延长消化时间。

甲醛能抑制DNA聚合酶的活性，用有机法抽提DNA后，再用chelex-100提取一次，这样可以提高检出率。

（2）DNA分型扩增片段长度多态性分析提取组织的DNA后，PCR扩增、STR分型。

第二节人体软组织检验案例

Thecasesofhumanparenchymainspection

案例一CaseOne

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某一女子医院诊断其患有乳腺癌，医院按乳腺癌进行治疗，后该女子认为自己没有患乳腺癌，医院病理科挑错了组织切片，错误的诊断自己患了乳腺癌，要求对当时送检的诊断为乳腺癌的组织切片进行鉴定，以明确该组织切片是否是自己的组织。

【实验室检验】Laboratoryinspections

刮取组织切片，加二甲苯1ml振荡后，放置2h，期间振荡数次，10000rpm,10min,去上清，反复2次，以达到彻底去除石蜡，用适量蒸馏水在70℃的水浴中孵育10min，此过程反复3遍，沉渣用有机法提取DNA，PCR扩增，STR分型，结果显示该组织切片的DNA分型与该女子血样的DNA分型一致，从而认定组织的石蜡切片是该女子的胸腺组织。

【启示】Conclusion

二甲苯为有机溶剂，可以溶解石蜡，石蜡和二甲苯的比重都比水小，会漂浮在水的上层，可通过离心去除。

经甲醛浸泡过的组织会发生DNA的降解，在DNA分析时须加以注意。

案例二CaseTwo

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某女子送来一瓶有甲醛固定十个月的流产组织。

要求鉴定该流产组织里的胎儿成分是否与犯罪嫌疑人有亲缘关系。

【实验室检验】Laboratoryinspections

仔细挑选出绒毛样组织，蒸馏水漂洗4遍，剪取少量组织并剪碎于1.5ml的离心管中，先用有机法提取样本DNA，再用Chelex-100第二次提取。

经PCR扩增并检测扩增产物。

STR分型结果认定该流产组织里的胎儿成分与犯罪嫌疑人有亲缘关系。

【启示】Conclusion

由于用甲醛固定的组织，其DNA降解很快，会影响DNA的检测，所以在提取检材时要尽量多提取些组织，选用有机法进行DNA提取，可以达到提取和纯化的目的。

再用Chelex-100第二次提取，可以得到满意的结果。

因此组织应采取什么方式进行固定显得很关键。

经无水乙醇固定的组织，其DNA的降解速率很慢，所以在固定需要进行DNA检测的组织时应尽量用无水乙醇固定组织。

案例三CaseThree

【案情简介】Casesummary

某天晚上，某地一居民楼被抢劫，犯罪嫌疑人戴口罩入室盗窃。

犯罪嫌疑人与女主人发上撕扯，女主人情急之中一把拽下犯罪嫌疑人所戴的口罩。

口罩是犯罪嫌疑人在现场的唯一物证。

经排查，找到两名嫌疑人，要求做同一认定。

【实验室检验】Laboratoryinspections

剪取近口鼻部位适量斑迹，剪碎置于1.5ml离心管中，用蒸馏水反复洗涤2-3遍，12000rpm离心10min；在沉淀物中加入5%chelex-100，37℃水浴箱中孵育过夜，然后将模板DNA经过磁珠纯化，最后进行PCR扩增并检测扩增产物，得到的STR分型。

从而认定犯罪嫌疑人。

【启示】Conclusion

口罩因为具有遮掩面容的特点，常被犯罪嫌疑人加以利用。

犯罪嫌疑人在戴口罩作案时，一般将口罩带的比较紧，因此口唇上皮细胞就极易留在口罩上。

如果在案件发生过程中，犯罪分子与受害人发生激烈的争夺，这样检出犯罪分子遗留在口罩上上皮细胞的几率还会大大增加。

借助此案的经验及思路，在遇到类似的案件时，可以尝试做一些工作，这将拓宽检测生物物证的范围（手套、眼镜、茶杯口、围巾等检材），增加案件的侦破率。

案例四CaseFour

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某市区一商店发生一起抢劫杀人案，现场勘查中仅发现一副近视眼镜，经摸排有四个嫌疑人可能与本案有关，提取相应检材送实验室检验。

【实验室检验】Laboratoryinspections

用纱布纤维沾取少量蒸馏水在镜架上与人体接触部位反复擦拭提取脱落上皮细胞。

用chelex-100法提取四个嫌疑人及镜架上脱落细胞的DNA，PCR扩增，STR分型发现镜架上脱落细胞的DNA分型与嫌疑人王某的DNA分型一致，认定现场遗留的眼镜是王某所留。

【启示】Conclusion

如果现场预留有眼镜可以考虑是嫌疑人所留，可取眼镜鼻架上的脱落上皮细胞与犯罪嫌疑人进行比对，以确定犯罪嫌疑人。

值得注意的是，表皮主要有无核的角化细胞组成，表皮脱落上皮细胞中含有核上皮细胞的几率非常低，这样一类检材检测成功率也很小，所以遇到此类案件应尽量多的提取检材，以保证得到满意的结果。

案例五CaseFive

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某市小区内发生一起凶杀案，一女子被勒颈死亡，经现场勘查找到一名犯罪嫌疑人，在其家中发现一布条疑为作案工具，提取相应检材送实验室检验。

【实验室检验】Laboratoryinspections

仔细观察布条，在可能接触的人体的部位取材，用蒸馏水反复洗涤3次，10000rpm,10min,沉渣用chelex-100法提取DNA，PCR扩增，STR分型，结果显示布条上的DNA分型与死者的DNA分型一致，从而认定该布条是作案工具。

【启示】Conclusion

一般的情况下，作案人对被害人进行勒颈时用力较大，同时由于被害人的挣扎抵抗，头部扭动，勒颈部位与颈部皮肤相互摩擦，导致被害人颈部的被勒处皮肤剥脱，从而可以从勒颈工具上检出被害人上皮细胞。

案例六CaseSix

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，有一女子前来我物证鉴定室要求对所怀胎儿的亲生父亲进行鉴定。

【实验室检验】Laboratoryinspections

在B超监测下抽取该妇女羊水10ml，放入离心管中，2000rpm,10min,取沉渣，用chelex-100法分别提取被检男子血样、母亲血样、羊水脱落上皮细胞的DNA，PCR扩增，STR分型，结果显示胎儿与被检男子之间存在亲缘关系，从而认定该男子为胎儿的亲生父亲。

【启示】Conclusion

一般情况下，对胎儿进行亲子鉴定有以下三种情况：

1.终止妊娠，引产取胎儿组织进行亲子鉴定。

2.人工流产取胎儿绒毛组织进行亲子鉴定。

3.抽取羊水取羊水中胎儿脱落上皮细胞，进行亲子鉴定。

对于早期的妊娠（16周以前）抽取羊水是相当困难的。

因为在早期妊娠羊水少，在抽取过程中容易伤及胎儿，会造成流产的危险，所以一般要求在妊娠16-20周，在B超监测下抽取羊水比较安全。

同时注意避免提取到血性羊水，因为在其中含有母亲的细胞。

另外对于非专业人员来说从人工流产组织里提取胎儿绒毛组织有一定的难度，容易取到母亲组织成分，所以最好由专业人员提取绒毛组织以保证取到胎儿绒毛组织。

案例七CaseSeven

【案情简介】Casesummary

某年，李某在交通事故中受伤后送医院抢救，手术后，公安机关取其血样及从肇事车辆上提取的血迹进行同一认定。

检验结果发现，李某的DNA分型中有多个基因座出现了3条或4条谱带，即有嵌合体的出现。

且有部分谱带与肇事车上的血迹的谱带吻合。

检验者怀疑被检对象在抢救过程中是否接受过输血，经公安部门确认，伤者确实输了约300ml的血。

在重新提取伤者的口腔拭子进行检验后，认定了肇事车辆。

【启示】Conclusion

对于这类近期内有过输血史及骨髓移植病史的个体，在利用血样进行个人识别时会带来一定的难度，因为接受输血的个体和骨髓移植的个体，其接受的外源血或骨髓与自身的血液形成嵌合体，在STR分型中，同一个STR基因座的分型会出现3-4个等位基因（受体加上供体）会造成判型上的困惑。

此时可提取被检对象的口腔拭子或毛囊进行检验，以便得到确切的检验结果和现场提取的生物检材进行比对。

案例八CaseEight

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某地杨某某到同村的“大老发”家打歌，在打歌处被张某某从打歌处拖到和尚庄树林的一间草房内强奸，致杨某某怀孕，后引产下一男婴，请公安机关调查处理。

对犯罪嫌疑人张某某进行审查，但其拒不交代犯罪事实。

提取杨某某引产下的男婴的肋软骨、皮肤、杨某某和张银富的血样送实验室进行亲子关系鉴定，结果张某某、杨某某与杨某谋引产下的男婴间存在亲缘关系，确认犯罪嫌疑人张某某。

【启示】Conclusion

在强奸致孕案中，常常涉及到受害者怀孕，要确定犯罪嫌疑人的情况，在妊娠12周以前，要行人工流产术终止妊娠，此时取出的不是完整的胎儿，而是一些组织碎片，这些组织碎片中既含有胎儿的组织碎片，也含有母体的子宫内壁成分。

要从中找出胎儿成分是比较困难的，一般一是要找胎儿的绒毛组织，二是要找胎儿的器官碎片（正常的手、脚碎片）如果挑选的不得当，会造成胎儿检验结果仍是母体组织的DNA分型。

案例九CaseNine

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，某县勐黄线发生一起交通事故，罗某某驾驶二轮摩托车行至勐黄线K0＋800m处时与李某某驾驶的大中型轮式拖拉机相撞，导致二轮摩托车上的乘车人俸某某受伤。

由于李某某不愿意承担相关责任，以不知道发生过事故为由进行推托，导致事故迟迟难以处理。

提取大中型轮式拖拉机右侧后尾部可疑人体组织碎屑，同时采集伤者的血样送检。

种属试验确定该可疑组织为人体组织，经Chelex法提取DNA进行检验，所送检人体组织碎屑基因型与俸某某的基因型一致，从而为这起交通事故的认定提供了科学依据。

【启示】Conclusion

在交通事故中，由于车辆和人体的瞬间接触，在车辆与人体接触的相应部位，会留下人体的生物成分，可以通过在车辆上寻找人体生物成分与伤者或死者进行同一认定，确定肇事车辆。

案例十CaseTen

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，在某地发生一起交通肇事，一丰田吉普撞在道路旁的护栏上，造成一死，一伤。

据伤者介绍，事发时，死者为驾驶员。

为查明案情，取前挡风玻璃及死者伤者血样送实验室检验。

【实验室检验】Laboratoryinspections

取纱布纤维两根，用蒸馏水沾湿，分别在驾驶座上方和副驾驶座上方的挡风玻璃处擦拭（前挡风玻璃在驾驶座上方和副驾驶座上方有头部撞击的痕迹）。

用蒸馏水反复洗涤3次，10000rpm,10min,沉渣用chelex-100法提取DNA。

PCR扩增，STR分型，结果显示伤者血样DNA分型与在驾驶座上方的挡风玻璃上提取的上皮细胞的DNA分型一致，死者血样DNA分型与在副驾驶座上方的挡风玻璃上提取的上皮细胞的DNA分型一致。

从而确定驾驶员。

【启示】Conclusion

在交通事故中，常常涉及到责任以及保险赔付问题，需要确认事发时的驾驶员，以明确责任及保险赔付问题。

当发生交通事故时，车内人员会发生受伤在相应部位会留下痕迹（血，人体组织等）。

可以通过提取相应部位的人体成分与车内人员进行比对以确定驾驶员。

案例十一CaseEleven

【案情简介】Casesummary

某年某月某日，李某某（女，19岁）被杀害后抛尸于宿舍外的小巷内，对其宿舍进行勘验时，提取到一段手机充电器电源线。

该电源线表面光滑，未发现明显附着物及人血痕。

经调查发现一男性嫌疑人有重大嫌疑，遂提取死者和嫌疑人血样，现场电源线送实验室检验。

【实验室检验】Laboratoryinspections

取纱布纤维4根，沾取少量蒸馏水，分别在现场电源线上分四段进行擦拭提取，同时提取死者和嫌疑人血样DNA检材，进行STR分型检验。

结果1号段检出的STR基因型与嫌疑人血样一致，2、3、4号段含有死者血样和嫌疑人血样STR基因型混合物。

【启示】Conclusion

痕量生物检材DNA通常指DNA少于100pg的模板。

有实验证明人体只要接触物体5秒钟,就有细胞遗留在物体上。

例如在帽子围巾上可能遗留的人体脱落上皮细胞；在烟头、口香糖等各种物体的咬痕上可能留有口腔上皮细胞；在贴身衣物、手表、眼镜、杯子、电话耳机、笔、牙刷、刀具、铁棍、雷管、引爆线及一些行凶工具等物体上可能留下使用者的表皮或上皮细胞。

由于痕量生物检材上的有核细胞少，不易提取、检出成功率很低且得不到可信