无菌操作消毒灭菌及培养基制备等微生物实验注意事项汇总.docx

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无菌操作消毒灭菌及培养基制备等微生物实验注意事项汇总

无菌操作、消毒灭菌及培养基制备等微生物实验注意事项汇总！

一、无菌操作要求

1.接种细菌时必需穿工作服、戴工作帽。

2.进行接种食品样品时，必需穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦洁净。

4.进行接种所用的吸管，平皿及培育基等必需经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

6.接种样品、转种细菌必需在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。

8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随便打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品。

3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采纳室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照耀时间不少于30min，使用紫外灯，应留意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以削减紫外线穿透的影响。

4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随便出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培育基、被污染和接种的培育物等，必需经灭菌后方能使用。

（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法

1、灭菌前预备

（1）全部需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。

（2）装培育基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

2、装放

（1）干热灭菌器：

装放物品不行过挤，且不能接触箱的四壁。

（2）大型高压蒸气锅：

放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3、设备检查

（1）检查门的开关是否敏捷，橡皮圈有无损坏，是否平整。

（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观看是手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）；

②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀裂开的灭菌器不得使用）；

③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）；

④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关状况而定）；

⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，马上打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应马上将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体猛烈沸腾或容器爆破。

（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：

①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出；

②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出；

③待锅室达到规定的压力与温度时，调整进气阀，使保持恒定至灭菌完成；

④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体猛烈沸腾或容器爆破；

⑤使用自动程序掌握式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应依据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必需利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格根据厂家说明书进行。

4、灭菌温度与时间

（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。

（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间一般为121℃,15min。

（二）间歇灭菌方法

1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌简单破坏，可用此法灭菌。

（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽；

（2）关闭排水口，打开进气门，依据需要消毒10～20min；

（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。

2、血清凝固器使用方法，培育基中含有血清或鸡蛋特别成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。

（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用；

（2）将培育基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

3、煮沸消毒：

可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应留意对物品的腐蚀性。

4、灭菌处理：

灭菌后物品，按正常状况已属无菌，从灭菌器中取出应认真检查放置，以免再度污染。

（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不行作为无菌物品使用；

（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不行作为无菌物品使用；

（3）培育基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃；

（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭；

（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不行作为无菌物品使用；

（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放；

（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限；

（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物试验所用试验器材、培育物等未经消毒处理，一律不得带出试验室。

1、经培育的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

2、经微生物污染的培育物，必需经121℃30min高压灭菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。

4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必需冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。

做凝集试验用的玻片或平皿，必需高压灭菌后洗涤。

5、打碎的培育物，马上用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭洁净。

污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

五、培育基制备要求

培育基制备的质量将直接影响微生物生长。

由于各种微生物对其养分要求不完全相同，培育目的的不同，各种培育基制备要求如下：

1、依据培育基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

2、PH测定及调整：

PH测定要在培育基冷至室温时进行，因在热或冷的状况下，其PH有肯定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。

培育基PH值肯定要精确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观看。

但需留意因高压灭菌可影响一些培育基的PH降低或上升，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培育基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。

3、培育基需保持澄清，便于观看细菌的生长状况，培育基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避开因琼脂含杂质而影响透亮     度。

4、盛装培育基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5、培育基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要留意不因加热而降低其养分价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培育基如糖类、血清、明胶等，则应采纳低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

6、每批培育基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。

假如是生化培育基，使用标准菌株接种培育，观看生化反应结果，应呈正常反应，培育基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。

7、目前各种干燥培育基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观看，各种培育基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培育基，在配制时也应测PH，使用时需依据产品说明书用量和方法进行。

8、每批制备的培育基所用化学试剂、灭菌状况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。

六、样品采集及处理要求

1、所采集的检验样品肯定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、四周环境卫生状况等进行具体调查，检查是否有污染源存在。

2、依据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

3、采样应留意无菌操作，容器必需灭菌，避开环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避开杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

4、样品采集后应马上送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。

5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观看样品的外观，假如发觉有下列状况之一者，可拒绝检验。

（1）样品经过特别高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。

（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品外形者（食物中毒样品除外）。

（3）按规定采样数量不足者。

对送检符合要求的样品，检验室收到后，应马上进行检验，假如条件不具备，应置4℃冰箱存放，准时预备制造条件，然后进行检验。

6、样品检验时，依据其不同性状，进行适当处理。

（1）液体样品接种时，应充分混合匀称，按量吸取进行接种。

（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。

（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，依据性状选择上述方法处理后接种。

七、记录和报告的要求

1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，准时根据国家标准检验方法进行检验，检验过程中要仔细、负责、严格进行无菌操作，避开环境中微生物污染。

2、样品检验过程中所用方法、消失的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求具体、清晰、真实、客观、不得涂改和伪造。