欧洲药典EP602612微生物限度.docx
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欧洲药典EP602612微生物限度
2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）
本章包括两种检验方法。
第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。
因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。
第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。
一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。
第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。
A．欧洲药典方法
该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。
如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。
该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。
此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。
如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。
执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。
避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。
如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。
如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。
测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。
当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（MostProbableNumber,MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。
任何选择的方法必须通过合理的验证。
当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。
样品制备：
抽样检验方法：
所选样品必须遵循抽样样品规则。
抽样检验的结果依赖于下列因素：
如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。
除了特别说明外，取10g或10ml物质或制剂检测，釆取上面提到的预防措施。
从大批样品中随机选择样品或从制剂容器中随机抽取。
如有必要，为了获得所需的样品，将容器中大量的内容物混匀以保证每一份样品都能包含在内，是否要这样做依赖于所检测物质或制剂的性质。
现举例说明适用于产品的抽样检验方法，而在该法中关于微生物分布状态的同质性方面可能存在问题，该例包括三类抽样检验方法。
在该例中有从每批中分别抽取五份样品。
以下是三种方法：
（i）可接受的样本：
例如：
样品包括不少于mCFU（菌落数）/gorml,m代表在相关专论中特定指出的限度。
（ii）边缘样本：
例如：
大于mCFU而小于10mCFU/gorml.
（iii）有缺陷的样本：
例如：
包含大于10mCFU/gorml.
水溶性产品：
溶解或稀释10g或10ml待测产品于氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）或另一种合适的液体中。
一般来说要准备好1/10的稀释液。
但是，根据产品特性或所需的敏感性可以考虑其它比例的溶液。
如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。
如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
不溶于水的非脂溶性产品：
将10g或10ml待测产品悬浮于氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液或另一种合适的液体中。
一般来说要准备好1/10的稀释液，但根据一些产品特性或所需的敏感性需要更大体积的液体。
可以添加合适的表面活性剂如1g聚山梨醇酯80来帮助不易润湿的底物悬浮液稳定。
如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。
如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
脂溶性产品：
取10g或10ml待测产品与不多于一半质量的灭菌聚山梨醇酯80或另一种灭菌表面活性剂混匀，如有必要可加热，但不超过40℃，如有例外情况下也不应高于45℃。
仔细混匀，如有必要可以维持温度在水浴中或恒温器中。
加充足的预热过的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液制成一倍或10倍原产品的稀释液。
仔细混匀同时维持温度使其能在最短时间内形成乳液状，但无论如何不要超过30分钟。
此外必须准备一系列10倍氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液包含有合适浓度的灭菌聚山梨醇酯80或其它灭菌表面活性剂。
贴剂：
用无菌镊子除去10批贴剂的表面保护膜（“线性释放”），将它们平放，粘性表面向上放于无菌玻璃或塑料皿中。
如有必要，粘性表面用无菌纱布（或纤维聚合物过滤膜）覆盖，然后转移这10批到最少500ML的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液中，该溶液添加有适当的灭活性如聚山梨醇酯80和/或卵磷酯。
剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）。
用同样的方法准备另10批样品，将它们放在最少500ML肉汤稀释液D中，剧烈振荡至少30分钟（得制备液B）。
样品检测
滤膜法：
所用滤膜膜孔直径不大于0.45微米，并且滤膜高效截留细菌的能力已知。
选择该种滤膜是因为用这种方法使细菌仍然侧够保持高效性同时不影响所测样品的成分。
例如硝酸纤维素滤膜可以使用于水溶液，油溶液和弱醇溶液。
醋酸纤维素滤膜可以用于弱醇溶液。
设计过滤器的目的就是转移培养基中的过滤物。
按照样品制备方法立即转移适量的制备样品（最好取有代表性的1g样品，如果所预期的菌落数多可以少点）分别到两层滤膜和滤器上。
每个过滤器洗三次，每次用大约100ml合适的液体如氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液。
在该溶液中可以加入适当的表面活性剂如聚山梨醇80或抗菌试剂的灭活性。
如果用于验证，则不少于三次洗涤。
如果主要是为了测定列举的细菌，则转移一个滤膜到合适的琼脂糖表面如介质B或其它介质上，如果主要是为了测定列举的真菌类，则转移滤膜到适当的琼脂糖表面如介质C。
培养琼脂糖介质B的平板在30-35℃，介质C的平板在20-25℃，培养5天，除非在短期内可得到可靠的菌落数。
平板计数法要选择最多菌落数不多于100个菌落的平板，计算每克或每ml产品中的菌落数。
当检测贴剂时，通过两层的无菌滤膜分别过滤50ml的制备液A。
将一个滤膜放置到琼脂糖B介质中用来计算总的需氧微生物菌落数，另一个滤膜到琼脂糖C用来计算真菌的菌落数。
平板菌落计数法
a.平板灌注法利用直径9cm的有盖培养皿，向每个培养皿中加1ml上述按样品制备方法制备的样品，然后再加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），在不高于45℃的条件下培养。
如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。
对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。
除非在短期内可以得到较好的菌落，一般情况下将平板在30-35℃下培养5天（真菌在20-25℃下培养5天）。
对每一种稀释液选择一种相应的平板，最多菌落数不少于300（对于真菌不少于100）。
计算菌落平均值和计算每克或每ML中菌落形成数。
b.表面延伸法利用直径9cm的有盖培养皿，在每个平皿中，45℃下，加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），然后使其固化。
如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。
干燥平板，例如在层流柜中或恒温培养箱中。
涂定量但不超过0.1ML的按照上述制备方法制取的样品于上述平板的表面上。
对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。
同平板灌注法一样培养和计算菌落数。
最大可能数（MPN）计算法
表2.6.12.1－细菌的最大可能数
在每一稀释条件下3个试管
阳性试管数
MPN/g
类型
95％可信任限度
0.1g
0.01g
0.001g
1
2
0
0
0
<3
-
-
0
1
0
3
x
<1
17
1
0
0
3
x
1
21
1
0
1
7
x
2
27
1
1
0
7
x
2
28
1
2
0
11
x
4
35
2
0
0
9
x
2
38
2
0
1
14
x
5
48
2
1
0
15
x
5
50
2
1
1
20
x
8
61
2
2
0
21
x
8
63
3
0
0
23
x
7
129
3
0
1
38
x
10
180
3
1
0
43
x
20
210
3
1
1
75
x
20
280
3
2
0
93
x
30
390
3
2
1
150
x
50
510
3
2
2
210
x
80
640
3
3
0
240
x
100
1400
3
3
1
460
x
200
2400
3
3
2
1100
x
300
4800
3
3
3
>1100
-
-
类型1：
正常结果，95％可信
类型2：
不太可能的结果，只有4％的可信度
这些结果不用于重要决定，比类型2还不可能的结果并未提到，这种结果也总是不可接受。
MPN的精确度和准确度不低于微孔滤膜法或平板菌落计数法。
特别对于列举的霉菌通常会得到不可信的结果。
因为上述原因，MPN法通常只有在没有其它合适的方法可用时才用来测定细菌。
如果该法可行，则方法如下：
按照样品制备法准备至少3个梯度的10倍稀释液。
对每一个稀释液，在3个试管中分别接种1G/ML的样品液在9-10ML合适的液体介质中（如肉汤介质A）。
如有必要，表面活性剂如聚山梨醇酯80或抗生素试剂灭活剂可以加到该介质中。
因此如果准备了3个梯度的稀释液则需要接种9个试管。
所有试管在30-35℃下培养5天。
记录每种稀释液的试官微生物的生长情况。
如果根据所测产品特性结果不好读或不确定，可以在同样的肉汤中再次培养，或在合适的琼脂糖介质中培养（如琼脂糖介质B），在同样的温度下培养18-24h,然后使用该结果。
从表2.6.12-1表格中确定每克或每ML产品中细菌的最大可能数。
高效的培养介质和有效的计数方法
将合适的细菌试验株分别在含有合适的液态介质（如肉汤介质A）的容器中在30-35℃下培养18-24h。
真菌试验株在合适的琼脂粮介质（如无抗生素的介质C）中在20-25℃下培养48小时如白色念珠菌，对曲霉菌在20-25℃下培养7天。
金黄色葡萄球菌例如ATCC6538（NCIMB9518,CIP4.83）
大肠杆菌例如ATCC8739（NCIM8545,CIP53.126）
枯草芽孢杆菌例如ATCC6633（NCIM8054,CIP52.62）
白色念珠菌例如ATCC10231（NCPF3179，IP48.72）
黑曲霉菌例如ATCC10231（IMI149007，IP1431.83）
用每ML氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液中大约含有100个形成菌落的悬浮液作为对照品。
用分别含有各种微生物的悬浮液作为计数法的控制，悬浮液分别加有被测产品和不加被测产品。
当用微孔滤膜法或平板计数法时，对于任何测定的微生物接种所得计算值不相差5倍。
对于从MPN法接种所得的计算值要在95％可信限度内。
为了检验介质和稀释液的无菌状态，用无菌的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液作为测试液。
在其上必须没有微生物生长。
结果解释
细菌数与琼脂糖介质B中的菌落平均数相等。
真菌数与琼脂糖介质C中的菌落平均数相等。
总的需氧菌数是上述两种菌之和。
如果有证据表明同种类型的微生物在这两种介质中生长则结果就是正确的。
MPN法所计算的值是细菌数。
专论中所规定的限度解释如下：
102微生物：
最大可接受限度：
5*102
103微生物：
最大可接受限度：
5*103
等。
如果使用抽样方式，如三步抽样法过程如下：
对每五个样品分别计算总的需氧菌数。
如果按照下面条件操作，则物或制备液通过了测试：
（i）没有单个的总需氧菌数超过了所预计限度的10倍或更多（如没有不可接受的样品）
（ii）不超过2个的总需氧数在预计限度和10倍限度之内（如没有两个边缘样品）
所推荐使用的溶液和培养介质将2.6.13中讲到。
B．协调法：
非无菌产品的微生物限度试验：
微生物列举试验
1.简介：
该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制备液是否符合微生物质量已制定的规定。
如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来解释结果。
该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。
可以使用自动收集法作为替代法，与药典所用方法具有同样效力。
2.一般操作过程
设计方法时所用条件要避免外在微生物对产品的污染。
必须釆取措施避免污染以便它们不影响任何所测微生物。
如果所测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。
如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。
如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。
3.举例方法
按规定用微孔滤膜法或平板菌落计数法。
MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但是，如果某些产品所含极少的微生物量，该法是最合适的方法。
方法选择基于下列因素：
如产品的特性和所要求的微生物量。
所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断该法的适应性。
所选方法的合适性必须确定。
4.促生长实验和计数法
4-1总则
在不加产品的条件下该试验能够检测微生物的能力必须已确定。
如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适应性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。
4-2试验菌株的准备
使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。
批种子培养技术（seedlotculturemaintenancetechniques,seed-lotsystems）的使用以至于用于接种的微生物从最初的主批种子转移走不多于5通道。
细菌和真菌试验株的生产分别见表格2.6.12-2。
使用氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液或pH7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。
对于曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。
如果在2-8℃下保存则该悬浮液要在2-24小时内使用。
作为一种可替代的制备方法，稀释含有曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有植物细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。
该孢子悬浮液可以在2-8℃保存到适合验证的时间。
4-3阴性对照
为了验证试验条件必须使用可选用的稀释液作为阴性对照来替代测试液。
在该阴性对照品中必须没有微生物生长。
4-4生长促进介质
测试每一批准备好的介质和每一批介质，要么准备脱水介质要么准备含有所描述的成分。
用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到含有大豆豆蛋白胨消化肉汤的液体/平板和大豆豆蛋白胨消化琼脂上，对每一种使用各自的含有介质的液体/平板。
用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到萨布罗－葡萄糖琼脂糖平板，对每一种使用各自含用介质的平板。
接种条件见表2.6.12-2。
对固体介质而言，对标准接种物来讲，所得的生长值不超过计算值的两倍。
与用先前的测试方法和验证的批介质所得的测试结果相比，新制备的接种物将会出现微生物的生长值。
与用先前的测试方法和验证的批介质所得的测试结果相比，如果清淅可见的微生物生长可见，则液体介质是合适的。
4-5对于所测产品合适的计数方法
4-5-1样品制备样品制备方法选择依赖于所测产品的物理特性。
如果下面所描述的方法均不合适的话，可选用替代方法。
水溶性产品溶解或稀释（通常1-10倍的稀释液需要准备）待测产品于氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液,pH7.2的磷酸缓冲液或干酪豆素消化液肉汤。
如有必要，调节pH6-8。
如果必要，可以准备更多倍的同样稀释剂的稀释液。
表2.6.12.-2-微生物制备和使用
微生物
受试菌株制备
促生长
在产品存在的情况下的计数方法的适应性
需氧菌总数
总酵母菌和霉菌数
需氧菌总数
总酵母菌和霉菌数
金黄色葡萄球菌
如：
ATCC6538
NCIMB9518
CIP4.83
NBRC13276
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
30-35℃
18-24小时
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
铜绿假单胞菌
如：
ATCC9027
NCIMB8626
CIP82.118
NBRC13275
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
30-35℃
18-24小时
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
枯草杆菌
如：
ATCC6633
NCIMB8054
CIP52.62
NBRC3134
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
30-35℃
18-24小时
酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤
≤100CFU
30-35℃
≤3天
白色念珠菌
如：
ATCC10231
NCPF3179
IP48.72
NBRC1594
沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤
20-25℃
2-3天
酪蛋白大豆消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
酪蛋白大豆消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN：
不能适用
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
黑曲霉菌
如：
ATCC16404
IMI149007
IP1431.83
NBRC9455
沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡糖萄糖琼脂
20-25℃
5-7天或者到达到很好的芽孢形成
酪蛋白大豆消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
酪蛋白大豆消化琼脂
≤100CFU
30-35℃
≤5天
MPN：
不能适用
沙氏葡萄糖琼脂
≤100CFU
20-25℃
≤5天
不溶于水的非脂类产品。
让受检产品（通常以1：
10稀释制备）悬浮在pH7.0的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤中。
加入例如1g/l的聚山梨醇酯80的表面活性因子来辅助几乎不可湿的物质的悬浮。
如果需要的话，把pH调节为6-8。
如果需要的话，用同样的稀释液进一步稀释。
脂类产品。
把受检产品溶解在豆蔻酸异丙脂中，通过过滤灭菌或把产品与最小需要量的无菌聚山梨醇酯80或其他的非抑制表面活性剂混合，如果需要的话加热到不超过40℃，或者在特殊情况下不超过45℃。
仔细混合且如果必要的话在水浴里保温。
假如足够量的预热的所选稀释液来制备原产品的1：
10的稀释溶液。
仔细混合同时在所需的最短时间内保温来形成乳化液。
可以使用含有合适浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制物均表面活性剂来制备进一步的一系列的十倍的稀释液。
气溶的液体或固体。
把产品无菌转移到一个膜过滤装置或者一个物均区容器中来进一步取样。
使用总含量或每个检查容器中的计量的确定的量。
透皮贴剂。
去掉透皮贴剂的保护覆盖垫（‘隔离衬垫‘）并把它们向上贴在无菌玻璃或塑料盘上。
用无菌多孔物质例如无菌纱布来覆盖粘贴面，来避免贴剂粘在一起并把贴剂转移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的灭活剂的所选的适当体积的稀释液中。
至少用力摇晃制备溶液30分钟。
4-5-2接种和稀释。
假如如上述制备的样品（4-5-1）到一个控制的（不包括被检物质）足够量的微生物混悬溶液中来获得一个不超过100CFU的接种体。
接种体的混悬液的体积不能超过稀释产品的体积的1%。
为说明产品的可接受微生物回收率，实验中应该使用制备样品的最低可能稀释因子。
如果因为抗微生物活性或者很差的溶解性而不可能，需要进一步探索合适的方案。
如果样品的生长的抑制时不可避免的，在中和，稀释或过滤后应假如微生物混悬液的代表性试样。
4-5-3中和/抗微生物活性的去除。
把如4-5-2所述的稀释制备的样品按照4-5-4中描述的规程进行接种回收的微生物的数量和与对照制备中回收的微生物的数量作比较。
如果生长被抑制（抑制因子大于2），修改列举的检查的过程来保证结果的有效性。
过程的修改可能包裹，例如，
（1）稀释液体积或培养基的增加，
（2）特殊的或一般的中和因子与稀释液的结合，（3）膜过滤，或（4）上述措施的组合。
中和因子。
中和因子可能被用来中和抗菌因子的活性（表2.6.12.-3）。
它们可能在灭菌前被加入到所选稀释液或更好的培养基中。
如果使用的话，它们的功效和对微生物无毒性必须通过使用中和因子不使用产品的空白实验进行说明。
表2.6.12.-3干扰物质的一般中和因子
干扰物质
可能的中和方法
戊二醛，汞
硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）
酚，醇，醛，吸着物
稀释
醛
氨基乙酸
季铵化合物（QACs），对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸酯），二-二双胍类
卵磷脂
QACs，碘，对羟基苯甲酸酯
聚山梨醇酯
汞剂
Thioglycollate硫乙醇酸盐
汞剂，卤素，醛
硫代硫酸盐
EDTA
Mg2+或Ca2+
若找不到中和方法，就可认为分离接种微生物失败归因为产品的微生物活性。
这一信息说明产品不可能被上述微生物微生物污染。
然而，产品可能只存在于在此提到的微生物中，但不存在于其他在此提到的微生物中。
然后，以与微生物生长和标准所允许的最高浓度系数进行试验。
4-5-4.在产品存在的情况下微生物的回收。
对以上列出的微生物进行分离试验。
仅计算加入测试菌的微生物。
4-5-4-1.膜过滤。
使用孔径不大于0.45μm的滤膜过滤。
选择滤膜材料类型时，要求滤膜对微生物的滞留能力不受到所观察样品成份的影响。
每种上述微生物使用一张滤膜。
将适量按4-5-1至4-5-3制备的样品（含1g产品，若预期CFU较大，则小于1g）用膜过滤，立即过滤并用适量稀释液冲洗滤膜。
将膜转移到豆酪素消化琼脂表面上，以确定厌氧菌总数（TAMC）。
将滤膜转移到沙氏葡糖琼脂上，以确定总酵母菌/霉菌（TYMC）按表2.6.12-2接种，进行计数。
4-5-4-2.平皿计数法。
至少在对各培养基复制菌使用平皿计数法，对结果取平均值。
4-5-4-2-1.浇碟法
在直径9cm的Petri碟中加入1ml按4-5-1至4-5-3法制备的样品以及15-20ml豆酪素消化琼脂或沙氏葡糖琼脂。
培养基温度均不超过45℃。
若使用更大的Petri碟，则琼脂的量也要相应增加。
对于每个表2.6.12.-2中列出的微生物，至少要使用2个Petri培养基。
根据表2.6.12.-2进行接种。
取各培养基的菌落数的数学平均值计算在原接种CFU的量。
4-5-4-2-2.表面涂布法
在各直径9cm的Petri碟中加入15-20ml豆酪素消化琼脂或沙氏葡糖琼脂，放置使其凝固。
培养基温度均不超过
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