版中国药典微生物限度检查方法验证方案.docx
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版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案
起草
部门：
QC组
签名：
日期：
审核
部门：
QC组
签名：
日期：
部门：
质量部
签名：
日期：
批准
质量负责人
签名：
日期：
质量部
颁发
本文件根据需要应分发于以下部门：
01质量部
下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
文件编号
修订原因
修订日期
TS-VP-4201-00
按GMP（2010年修订版）要求新制定
2015.10.22
1.概述
2.验证目的和范围
3.组织及职责
4.验证进度计划表
5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
6.验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认
7.验证项目和验证方法
7.1试验菌株
7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备
7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法
7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法
7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法
8.偏差与漏项控制
9.验证报告会审
1.概述
我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：
微生物计数法，以及1106：
控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
2.验证目的和范围
验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。
本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。
3.组织及职责
3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准
验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。
验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。
3.2验证方案的培训
验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。
3.3验证方案实施过程中的变更和偏差
验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。
3.4验证工作小组成员表
姓名
部门及职务
职责
黄汉新
质量负责人/质量受权人
负责验证方案及报告的批准
胡建新
质量部QA组长
审核验证方案、审核验证报告并协调工作
曾凤敏
质量部QC组长
负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作
刘红华
质量部QC
负责验证方案起草、具体实施、报告工作
4.验证进度计划表
本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。
5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
5.1.主要检验仪器设备确认表
序号
仪器设备名称
型号
编号
校准单位
校准日期
有效期至
1
电子天平
2
生化培养箱
3
生化培养箱
4
生化培养箱
5
立式压力蒸汽灭菌锅
6
生物洁净安全柜
检查人/日期：
复核人/日期：
5.2.验证所需文件的确认表
文件名称
文件编码
是否有效版本
文件保存处
《人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准》
□是□否
质量部
《人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程》
□是□否
质量部
《取样操作规程》
□是□否
质量部
《微生物限度检查操作规程》
□是□否
质量部
《微生物实验室清洁消毒操作规程》
□是□否
质量部
《培养基的管理制度》
□是□否
质量部
《检定菌的保存、传代、使用、销毁规程》
□是□否
质量部
《LDZX-30FBS立式压力压蒸汽灭菌器操作规程》
□是□否
质量部
《SPX-150B生化培养箱操作规程》
□是□否
质量部
《BHC-1300IIA/B3生物洁净安全柜操作规程》
□是□否
质量部
《JJ200电子天平操作规程》
□是□否
质量部
检查人/日期：
复核人/日期：
6.验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认
6.1.试验菌种检查表
序号
菌种名称
代码
冻干菌种
批号
来源
1
金黄色葡萄球菌
CMCC（B）26003
中国食品药品检定研究院
2
铜绿假单胞菌
CMCC（B）10104
中国食品药品检定研究院
3
枯草芽孢杆菌
CMCC（B）63501
中国食品药品检定研究院
4
白色念珠菌
CMCC（F）98001
中国食品药品检定研究院
5
黑曲霉
CMCC（F）98003
中国食品药品检定研究院
6
大肠埃希菌
CMCC（B）44102
中国食品药品检定研究院
7
乙型副伤寒沙门菌
CMCC（B）50094
中国食品药品检定研究院
检查人/日期：
复核人/日期：
6.2试验所需的培养基检查
序号
名称
生产厂家
是否通过培养基适用性试验
批号
01
胰酪大豆胨液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
02
胰酪大豆胨琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
03
沙氏葡萄糖液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
04
沙氏葡萄糖琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
05
麦康凯液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
06
麦康凯琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
07
RV沙门菌增菌液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
08
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
09
三糖铁琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
检查人/日期：
复核人/日期：
6.3.检验样品确认表
序号
品名
生产厂家
批号
规格
是否按GMP要求生产
1
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑0.2g
人工牛黄5mg
□是□否
2
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑0.2g
人工牛黄5mg
□是□否
3
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑0.2g
人工牛黄5mg
□是□否
检查人/日期：
复核人/日期：
7.验证项目和验证方法
7.1试验菌株
人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。
试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备
分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。
加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。
验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。
7.3.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法
7.3.1.供试液的制备
取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：
10的供试液。
7.3.2.试验组
取1：
10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。
置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取1：
10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。
置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.3.供试品对照组
取1：
10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。
置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
另取1：
10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。
置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.4.菌液对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。
置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。
置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。
7.3.5.常规倾注平皿法方法验证的接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0.5〜2范围内。
7.3.6.常规倾注平皿法方法验证的结果
7.3.6.1.常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果
试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数2：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数3：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
7.3.6.2.常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果
试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数2：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数3：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
7.3.7.常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结
按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。
如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。
7.4.需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法
7.4.1.供试液的制备
取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：
10的供试液贮备液。
取1:
10的供试液贮备液50ml，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。
7.4.2.试验组
取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。
每株试验菌株平行制备2张滤膜。
取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
7.4.3.供试品对照组
取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。
取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养5天，点计菌落数。
7.4.4.菌液对照组
取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，200ml通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。
每株试验菌株平行制备2张滤膜。
取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
7.4.5.稀释剂对照组
依照7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。
取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。
取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。
7.4.6.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值（即试验菌的回收率）应在0.5〜2范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0.5〜2范围内。
7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果
试验次数1：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数2：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
试验次数3：
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：
培养箱型号编号；培养温度：
；培养时长：
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
试验人/日期：
复核人/日期：
7.4.8.离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结
按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。
人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。
7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法
若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中，证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。
7.5.1试验菌株
人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。
试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
7.5.2控制菌检查方法验证的菌液制备
分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7
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