荧光相关光谱FCS在生物活细胞中的应用资料下载.pdf

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问题；

应用中图分类号：

503；

-334文献标志码：

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2004-06-24作者简介：

游俊（1969-），女，华中科技大学博士生，湖北大学学报编辑部副编审荧光相关光谱（FCS）是一种统计小样本中荧光分子的荧光强度波动的相关分析方法.在这种方法的经典模式中1，样本体积被聚焦激光束和共焦小孔所限定.样本发出的荧光被高数值孔径的显微镜物镜所收集，然后被灵敏的单光子计数器所监测.被探测到的荧光是随时间波动的，且这些时间函数是自相关的.归一化的荧光波动自相关函数提供了两类信息，函数的大小反比于所观测的荧光分子的平均数量，时间衰退的速率和形态反映了所观测的荧光分子的动力学特征.发明FCS的最初目的是在生物系统中研究非常稀的样本浓度的化学动力学特征，例如研究嗅乙非啶溴化物与DNA间的可逆接合反应，嗅乙非啶溴化物是一种可发荧光的核酸合成抑制剂.之后的一些理论和实验研究证明FCS不但能够测量扩散系数，而且能够测量化学速率常数、浓度、聚合和旋转动力学参数.在此基础上KOppeI等（1976）将共聚焦显微镜几何学引入到FCS中，使得细胞膜中脂质扩散研究取得了巨大进展，这项方法沿用至今.最近，由于在探测手段、自相关电子学等方面的技术进步，以及共聚焦显微镜被整合到FCS中，FCS在生物化学中的研究和应用越来越广泛.除了传统的分子浓度和扩散时间的测量，当它们引起的荧光波动在时间范围内快于扩散时间时，FCS还可测量分子动力学或化学反应的动力参数，这包括单分子反应、跨系统转运、三态动力学、光转换和可逆的光漂白.但是大多数生物过程发生时，在时间范围内都慢于扩散时间，例如核酸杂交、配体与蛋白质结合以及酶翻转等.SamueIT.Hess等探讨了FCS在溶液中的这两项功能的潜在应用2，但是在生物活细胞中的应用还有许多问题和困难需要解决.$生物活细胞研究所面临的问题复杂性是目前细胞生物学研究面临的主要挑战之一.一些复杂的细胞生物学过程，例如细胞周期控制、细胞凋亡、信号转导、胞内运输、器官发生以及细胞迁移等都是受到生物分子的相互作用而调控的，这种分子间的相互作用涉及到大量不同种类分子.染色体组和蛋白质组最初是被定义为调节复杂细胞生物学过程的分子相互作用网络.能否用计算机建模技术来分析这样的一些分子相互作用网络，主要取决于胞内的一些定量数据是否可靠和有效，这些数据包括分子相互作用网络中，每个分子种类的胞内浓度和扩散系数，以及网络中每个分子相互作用的动力学参数（包括进、出速率）.首先，确定网络中的分子相互作用在活细胞内是否真实地出现是很重要的.分子相互作用网络通常只是定性描述了在体外或一些特殊的异质系统中出现过的分子相互作用，这些分子相互作用是否真的第27卷第1期2005年3月湖北大学学报（自然科学版）JOurnaIOfHubeiUniversity（NaturaIScience）VOI.27NO.1Mar.，!

2005出现在活细胞内，主要决定于每一分子种类的局部浓度、扩散特性和每个分子间相互作用的动力学参数.如果这些参数已知，计算机模型就可以用来确定，分子网络中所蕴含的分子相互作用在所研究的特殊细胞类型中是否出现的概率.其次，确定网络中的分子种类和相互作用是否足以解释生物系统中所观察到的分子行为也很重要.同样，如果上述3个参数已知，计算机模型就可以用来确定网络中的分子种类和相互作用是否足以产生实验中所观察到的系统行为.第三，了解网络中各种亚系统是如何相互作用，从而产生我们所观察到的复杂实验行为或现象，同样是非常重要的.亚系统是一些能完成某种特殊功能的分子团，亚系统的功能完成是半自主性的，它们通过共享的分子种类来实现在全局系统的相互联系.分子相互作用的复杂性，通常排除了解析各种不同的亚系统结构是如何相互作用的.然而，如果上述3个参数已知，计算机模型就可以用来帮助我们理解不同的亚系统相互作用，同时为我们提供数字化的解决方案.因此，分析分子相互作用网络就要求用计算机模型，而这必须要求有分子相互作用网络中每个分子种类的胞内浓度和扩散系数，以及网络中每个分子相互作用的动力学参数（包括进、出速率）这3个定量数据.遗憾的是，这类定量数据在目前的细胞生物学文献中并不多见，因此产生了描述分子相互作用网络与用计算机技术来对其进行分析的瓶颈问题.某些特殊的分子种类浓度和某些特殊分子相互作用的动力学参数，在体外用常规的生物化学技术和方法是很容易测定的.但是，这些技术通常都不能直接应用于生物活细胞标本之中，因为分子拥挤、细胞质粘性和扭转等，在活体中与在溶液中的分子行为会有数量上的区别.令人欣慰的是，FCS可以被用来测量活细胞内单个荧光分子的胞内浓度、扩散和动力学参数，因此为我们提供了一种能定量分析分子相互作用网络的有效方法3.!

#$在细胞膜上的应用FCS第一次在细胞膜上的成功测量是Elson等于1976年报道的.然而FCS在细胞内的测量易受自发荧光的干扰以及细胞光损害和光漂白导致的光微扰现象的影响.双光子激发将这些问题降低到最小，为FCS在活细胞中的应用提供了准确的测量.NADH（还原型烟酰胺二核苷酸）和黄素蛋白大多位于细胞线粒体内，是自发荧光的两种主要物质来源.这种FCS细胞内的自发荧光，可通过精心选择荧光标记来使之最小化.因为NADH和黄素蛋白是典型的慢荧光量子产生，很容易光漂白，如果在通过观察体积的扩散时间内，每个荧光团的平均贡献小于1个可探测光子，则它们的信号将不会有效关联.因此自发荧光的出现，可能影响相关曲线的振幅即!

值，但不会影响滞延参数，且这种影响是可以作为背景参量而消除的.稳定的内源荧光是典型的易被光漂白对象，但光漂白速度极快，因此它对FCS信号的影响可以忽略不计.细胞膜是许多重要细胞功能的守门人，由于它经常有一些可以忽略不计的自发荧光产生，使得它们为细胞内FCS提供了良好的环境.脂双层的厚度（约4nm）比经典的FCS观测体积（约1!

m）的轴向长度小3个数量级，因此荧光标记在膜中的扩散可以看作是二维空间的扩散.早期的FCS在膜中的应用是20世纪70年代，包括膜系统模型，如平面脂双层膜系统模型.活细胞中类似的FCS测量与FRP（纤维增强塑料）结合的扩展应用由Elson等于1976年提出.1999年Korlach等又通过FCS与激光扫描显微镜的融合，对不同的脂类混合物的相分离模式和平衡共存特性进行了测定.这种方法测定的扩散指数与用FPR（荧光漂白恢复）测定的结果相符，主要是用掺杂有亲脂性染料的巨大单层囊泡（GUVs）来研究脂相分离.实验中发现用简单扩散是不足以描述观察到的GUVs的相转化或真实的细胞膜的相关曲线的.假定有不规则亚扩散或两个扩散样本的总和，改进合适的残留物；

而另一方面，当不规则亚扩散模型可以回答许多我们感兴趣的生物学问题时，不规则亚扩散模型和几个扩散样本的重叠是很难区别的，或许还需要更多的研究.了解配体与膜受体在自然环境下相互作用的机理是开发治疗性药物的基础.但是这些分子在生理环境下的缺陷和高亲和力反应的经典模式是要求用放射性方法进行分析的，现在用FCS可很容易地监测纳摩尔浓度的分子特性并且可以在细胞表面进行.用FCS来进行配体与膜受体相互作用的研究，最45湖北大学学报（自然科学版）第27卷开始是在体外，所测定的结合常数与用放射性分析方法测定的基本相符.为了解配体与膜受体在单细胞水平的结合，RigIer等在1999年采用了相对较大的观测体积，并同时检测在细胞膜上和外层空间的用荧光标记的胰岛素原C肽的2D和3D扩散.实验中对人工培养的人类细胞上的几种胰岛素原C肽类的小于纳摩尔浓度的结合亲和力进行了测定，同时采用竞争性取代和药物抑制研究，对受体调控的结合专一性进行了研究.3细胞内结构及胞内动力学研究3.1细胞内结构分析采用FCS已经在单细胞水平对细胞质结构和细胞核进行了探测.PoIiz等1998年在人工培养的大鼠成肌细胞的细胞核中测量了核酸的扩散和杂交，正如所期望的一样，从FCS测量所获得的关于细胞内结构的一些拟合参数反映了细胞内微环境的高度异质性.通过对细胞内微环境的异质性的了解，以及能在单细胞水平检测分子特性，将会对了解生物学过程起巨大的促进作用.例如，在CIuzeI（2000）4的实验中，如果不是FCS能在单细胞水平检测信号分子的浓度，在E.coli中对趋药性途径的高度协同性的研究将只能测定总体平均值.在自然生理环境下进行细胞研究代表了一种挑战，但FCS能解决这一问题，它既考虑了灵敏性，又考虑了空间和时间分辨率.然而对FCS的一些实验基础理论仍需要进行更深入的研究.GennerichandSchiId（2000）5通过检测被限定在细胞内腔的荧光标记物的扩散，证明了FCS数据分析中的复杂性.如果能够解决细胞内环境研究的复杂性，FCS将会是单细胞水平研究中的有力工具.3.2胞内动力学研究6由于有明显的自发荧光的出现以及一些可能的光漂白、荧光闪动和简单的细胞运动的影响，FCS在探测胞内动力学时会面临一些挑战.因此，为研究FCS应用的可行性，最开始的一些研究主要是针对浓度、GFP结构移动的迁移率以及在胞内环境中荧光分子的微注射或荧光分子的导入7，8.在测定胞内动力学时，对单光子FCS和双光子FCS9、FCS和PCH（光子计数方图）8也进行了比较研究.最近又有几例关于将局部FCS应用到胞内环境中进行转移测量的报道，其中一例是测量胞内用GFP标记的趋药性信号蛋白浓度与E.coli鞭毛动力蛋白活性的相关性4，另外的两例分别是在植物细胞的质体微管和细胞质内监测和分离活性与扩散性转移GFP10，在鱿鱼的巨型轴突中描述微管蛋白的转运模式11.4结论作为一种可以广泛应用于生物学中，可分析多种生理现象的监测方法，FCS已经连续获得了巨大的发展.这些可用FCS分析的生理现象包括分子相互作用的热力学和动力学，转运过程和激发态动力学.最近由于包括双光子激发、PCH分析、互相关、影像相关、衰减光照射等方法技术上的改进，使得FCS可多方面应用，FCS现已被有效地应用于多种生物系统，如配体与受体相互作用12、与疾病有关的蛋白质聚合、DNA和蛋白质相互作用、蛋白质与蛋白质相互作用13、膜域和细胞表面受体聚类等.目前已有大量的研究工作是针对GFP14和其它一些可能会适合于活体研究的探针的激发态动力学的，这方面的一些最新研究成果表明，FCS将是一种可以广泛应用的方法，不仅可以在溶液中描述过程特征，也可以在全能细胞和它们的膜中分析一些生理生化过程特征1518.参考文献：

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1652.55第1期游俊：

荧光相关光谱（FCS）在生物活细胞中的应用5GennerichArne，SchiIdDetIev.FIuorescencecorreIationspectroscopyinsmaIIcytosoIiccompartmentsdependscriticaIIyonthedif-fusionmodeIusedJ.BiophysJ，2000，79：

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7485.ApplicationsoffluorescencecorrelationspectroscopyinlivecellYOUJun（CoIIegeofLifeScienceandTechnoIogy，HuazhongUniversityofScienceandTechnoIogy，Wuhan430074，China）Abstract：

FIuorescencecorreIationspectroscopy（FCS）isamethodinwhichthefIuorescenceintensityarisingfromaverysmaIIvoIumecontainingfIuorescentmoIecuIesiscorreIatedtoobtaininformationabouttheprocessesthatgiverisetofIuctuationsinthefIuorescence.ThecapabiIityofFCSasananaIyticaItooIextendsbeyondthemeasure-mentsofmoIecuIarconcentrationsanddiffusiontimes.KineticparametersofmoIecuIardynamicsorchemicaIreac-tionsareaIsoaccessibIe.RecentIy，technoIogicaIadvancesindetectors，autocorreIationeIectronics，extendthehorizonofFCSinbioIogicaIandchemicaIstudies.FCScanprovidethereguisiteguantitativedataforanaIysisofmoIecuIarinteractionmetworksunderIyingcompIecceIIbioIogicaIprocesses.ButcurrentIy，FCSappIicationintheIiveceIIstiIIcontainedmanyprobIemstoberesoIved.PotentiaIappIicationsofFCSinIiveceIImeasurement，incIud-ingmoIecuIarinteractionnetwork，ceIIuIarmembranes，ceII-surfacereceptors，intraceIIuIarcompartment，intraceIIuardynamicsarediscussed.Keywords：

fIuorescencecorreIationspectroscopy（FCS）；

IiveceII；

probIem；

appIication（责任编辑晏建章）65湖北大学学报（自然科学版）第27卷荧光相关光谱（FCS）在生物活细胞中的应用荧光相关光谱（FCS）在生物活细胞中的应用作者：

游俊，YOUJun作者单位：

华中科技大学,生命科学与技术学院,湖北,武汉,430074刊名：

湖北大学学报（自然科学版）英文刊名：

JOURNALOFHUBEIUNIVERSITY（NATURALSCIENCE）年，卷（期）：

2005,27

（1）被引用次数：

1次参考文献（18条）参考文献（18条）1.MagdeD;

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