大肠菌群检测作业指导书Word格式文档下载.docx

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2℃～5℃

5.3恒温水浴箱：

46℃±

5.4天平：

感量0.1g

5.5均质器

5.6振荡器

5.7无菌吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头

5.8无菌锥形瓶：

容量500mL

5.9无菌培养皿：

直径90mm

5.10pH计或pH比色管或精密pH试纸

5.11菌落计数器

6.培养基和试剂：

6.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：

见附录A中A.1

6.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：

见附录A中A.2

6.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：

见附录A中A.3

6.4磷酸盐缓冲液：

见附录A中A.4

6.5无菌生理盐水：

见附录A中A.5

6.6无菌1mol/LNaOH：

见附录A中A.6

6.7无菌1mol/LHCl：

见附录A中A.7

第一法大肠菌群MPN计数法

7.检验程序：

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

图1 

大肠菌群MPN计数法检验程序

8.操作步骤：

8.1样品的稀释

8.1.1固体和半固体样品：

称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:

10的样品匀液。

8.1.2液体样品：

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

8.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

8.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液。

8.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

8.2初发酵试验 

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±

1℃培养24h±

2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±

2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±

2h，产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

8.3复发酵试验 

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±

1℃培养48h±

2h，观察产气情况。

产气者，计为大肠菌群阳性管。

8.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按8.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

第二法大肠菌群平板计数法

9.检验程序：

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

图2大肠菌群平板计数法检验程序

10.操作步骤：

10.1样品的稀释

按8.1进行。

10.2平板计数

10.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。

同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

10.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。

翻转平板，置于36℃±

1℃培养18h～24h。

10.3平板菌落数的选择

选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

10.4证实试验

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±

1℃培养24h～48h，观察产气情况。

凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

10.5大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以10.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。

例：

10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：

100×

6/10×

104/g（ml）=6.0×

105CFU/g（mL）。

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

A.1.1成分

胰蛋白胨或胰酪胨 

20.0g

氯化钠 

5.0g

乳糖 

磷酸氢二钾（K2HPO4） 

2.75g

磷酸二氢钾（KH2PO4） 

月桂基硫酸钠 

0.1g

蒸馏水 

1000mL

pH6.8±

0.2

A.1.2制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。

分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

A.2.1成分

蛋白胨 

10.0g

乳糖 

牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 

200mL

0.1%煌绿水溶液 

13.3mL

蒸馏水 

800mL

pH7.2±

0.1

A.2.2制法

将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。

A.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

A.3.1成分

蛋白胨 

7.0g

酵母膏 

3.0g

氯化钠 

胆盐或3号胆盐 

1.5g

中性红 

0.03g

结晶紫 

0.002g

琼脂 

15g～18g

pH7.4±

A.3.2制法

将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。

煮沸2min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。

使用前临时制备，不得超过3h。

A.4磷酸盐缓冲液

A.4.1成分

磷酸二氢钾（KH2PO4） 

34.0g

500mL

pH7.2

A.4.2制法

贮存液：

称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。

稀释液：

取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。

A.5无菌生理盐水

A.5.1成分

8.5g

A.5.2制法

称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

A.61mol/LNaOH

A.6.1成分

NaOH 

40.0g

A.6.2制法

称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

A.71mol/LHCl

A.7.1成分

HCl 

90mL