常用培养基Word下载.docx
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2.3%
氯霉素
0.02%
pH
2.0
（土豆切丁煮沸20min，纱布过滤，滤液定容：
每200g土豆定容1000ml水）
2、高氏一号培养基
KNO3
0.1%
NaCl
FeSO4.7H2O
0.001%
可溶性淀粉
K2HPO4
0.05%
MgSO4
0.05%
3、牛肉膏－蛋白胨培养基
蛋白胨
1.0%
0.5%
牛肉膏
2.1.1.3实验主要设备与仪器
培养皿、试管若干
三角瓶：
200ml、300ml、500ml、1000ml
天平：
美国赛多利斯公司BP121S型
高压灭菌锅MLS3750SANYO
恒温培养箱MIR－253SANYO
洁净工作台AirTech苏州安泰空气技术有限公司
2.1.1.4实验试剂
麦芽糖B.R.
甘露醇B.R.
牛肉膏B.R.
蛋白胨B.R.
硫酸镁A.R.
氯化钠A.R.
琼脂A.R.
味精A.R.
葡萄糖A.R.
盐酸A.R.
蔗糖A.R.
磷酸二氢钾A.R.
磷酸氢二钾A.R.
七水合硫酸亚铁A.R.
2.1.2实验方法
2.1.2.1样品分类
建水紫陶土壤红色样1#建水锰矿土壤1号样
红色样2#2号样
黄土3号样
白土（砂）建水锰矿放电锰（MnO2）1#
紫土放电锰（MnO2）2#
黑土放电锰（MnO2）3#
五色混和泥冶金锰1#
建水紫陶半成品样冶金锰2#
冶金锰3#
2.1.2.2涂布
a.土壤样品，配三个浓度梯度0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml的土壤悬浊液并涂布平板。
置于28°
C培养箱中培养。
比较后选择0.1mg/ml浓度。
b.矿石样品在无菌环境以少量无菌水冲洗表面，吸取冲洗液0.3ml涂布平板。
2.1.2.3纯化
菌落长出后将平板上的单菌落挑出，划线分离，置于28°
待长出菌落后，挑取单菌落接种于斜面上，置于28°
待生长好放入4°
C冰箱保藏。
2.1.3结果与讨论
对17个样品进行微生物分离，纯化，总共分到90株酸性环境微生物，包括真菌75株，放线菌15株。
其中，从锰矿中分得29株菌，从锰矿土壤和紫陶土中分得61株菌（见图1，表1）。
可见在矿区酸性环境下，比较高等的真菌生长更好。
在锰矿土壤和紫陶土中可分到大量菌株，而在锰矿中分到的菌种有限。
提示土壤中营养成分可能更加丰富，利于微生物生长。
17个样品中，建水锰矿土壤、黄土、白土（砂）、五色混和泥、红色样1#、红色样2#,建水锰矿放电锰（MnO2）3#中分离得到的菌株较多。
三种固体培养基中，PDA培养基分到39株，高氏一号培养基分到19株，牛肉膏-蛋白胨培养基分到32株。
真菌在三种固体培养基中都可以生长；
放线菌主要在PDA培养基上长出。
图1菌株分离及纯化后的部分菌株照片
表1分离菌株统计表
样品类别
锰矿
紫陶土壤
种类
菌株数
总菌株数
真菌
31
放线菌
10
44
5
41
49
2.2菌株的TLC排重和细胞毒活性筛选
2.2.1实验材料
2.2.1.1菌株来源
从云南建水锰矿与紫陶土中分得的75株真菌和15株放线菌。
2.2.1.2培养基
真菌二号
甘露醇
麦芽糖
葡萄糖
1%
味精
KH2PO4
MgSO4
0.03%
酵母浸膏
0.3%
放线菌六号
酵母浸粉
CaCO3
甘油
2.2.1.3实验仪器与设备
20*200试管若干
真空浓缩仪：
Savant公司SC250DDA型。
美国赛多利斯公司BP121S型。
三用紫外仪：
上海嘉鹏科技有限公司ZF-6型。
试管式振动培养箱TC－C－100R高崎科学器械株式会社TIC
SPECTRAMAXplus型酶标仪：
美国MolecularDevicesCorporation
冷冻离心机Biofugefresco型和Biofugeprimo型（Heraeus公司）
相差倒置显微镜CK40（OLYMPUS公司）
二氧化碳培养箱MCO175（SANYO公司）
超净工作台MCV-131BNF（T）（SANYO公司）
电动吸引机YB-DX23B（上海医疗器械工业集团公司）
2.2.1.4实验试剂
甲醇
乙酸乙酯
5%、80%乙醇
氯仿
80%三氯醋酸
1%醋酸
0.4%SRB的1%醋酸溶液
Tris非缓冲液
2.2.2实验方法
2.2.2.1发酵
用20*200试管装5ml培养基，将真菌接种于真菌二号培养基，放线菌接种于放线菌六号培养基，试管摇床28℃、205rpm振荡培养，培养9天以上直至菌体长成熟。
2.2.2.2发酵物浸膏的提取
向发酵液以1：
2加入萃取液，萃取液甲醇：
乙酸乙酯为1.5：
8.5。
发酵液及菌体破碎。
加入乙酸乙酯，振荡混合,静置过夜。
滤取乙酸乙酯层，真空浓缩得浸膏。
浸膏提取流程：
2.2.2.3固相萃取
取浸膏以5%乙醇溶解上样（XAD-16树脂柱），用固相萃取仪以5%乙醇洗脱，除去糖和无机盐，馏分收集10ml后弃去。
再用80%乙醇洗脱，收集馏分10ml。
余在柱上为脂肪酸等，纯乙醇处理，回收树脂。
将80%乙醇洗脱收集的馏分浓缩，得浸膏，转移至eppendorf管，称重并记录。
2.2.2.4TLC排重
取固相萃取后浸膏，以氯仿：
甲醇1：
1溶解，高效薄层板点板排重。
分别
以两个系统：
9:
1CHCl3-MeOH以及6:
2:
1AcOEt-MeOH-H2O展开，紫外荧光灯254nm下观察，5%磷钼酸及5%香草醛-浓硫酸显色。
2.2.2.5活性测试
取对数生长期的小鼠白血病P388细胞，用新鲜的DMEM培养基配制成密度为每毫升2×
104个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中。
预培养24h后，每孔加入2微升样品，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征。
每孔细胞中加入80%三氯醋酸50微升，置于4oC固定1.5小时，用水冲洗5次并空气干燥。
每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液150微升并在室温静置30分钟。
用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。
每孔加入150微升Tris非缓冲液（10mmol/L,pH10.5）溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶标仪测定每孔在515nm处的光密度（OD）值。
在同一块96孔板中每个样品均设置三孔，另设三孔空白对照（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。
取三孔平均OD值按IR%=（OD空白对照-OD样品）/OD空白对照X100%式计算该浓度下的细胞增殖抑制率（IR%）。
2.2.3结果与讨论
部分菌株发酵时生长缓慢,长势弱,菌体量少,这一现象在从锰矿样品分离到的菌株和放线菌中尤为普遍。
宜适当延长在试管摇床中培养的时间，9-21天，每日观察菌体量以确定培养时间。
TLC是一种简便，灵敏的方法，可以提供一定的菌株代谢产物的信息。
不同菌株可产生相同的次级代谢产物。
因此TLC排重可行。
经过TLC排除重复的菌株，能够减少活性测试及后续化学实验部分的重复工作，所以此步为必须步骤。
经排重留下54株（见图2）。
图2部分菌株TLC点板照片
（展开剂：
CHCl3-MeOH9:
1，AcOEt-MeOH-H2O6:
1；
显色剂5%磷钼酸和5%香草醛-浓硫酸。
）
经活性筛选，测得活性菌株数为15株，其中真菌8株，放线菌7株（见图3、表2、表3）。
通过活性筛选结果可知，放线菌虽然分到的数量不多，但活性率较高。
从锰矿，锰矿土壤和紫陶土中都分离得到了活性菌株。
通过本论文的研究，表明酸性环境存在着大量的微生物，其中部分微生物显示了较好的抗肿瘤生物活性。
这说明酸性环境微生物也是活性物质研究的重要的资源菌株，其研究前景及开发潜力十分广阔。
图3活性菌株的细胞活性图
表2菌株活性筛选结果
总计
40
14
54
活性菌株数
8
7
15
筛得率
20.00%
50.00%
27.78%
表3活性菌株统计
菌株编号
种类
样品来源
照片
JS-85
冶金锰1#
JS-82
白土（砂）
JS-48
建水锰矿土壤1号样
JS-57
建水锰矿土壤3号样
JS-61
黄土
JS-77
JS-60
JS-36
五色混和泥
JS-22
放电锰（MnO2）2#
JS-45
黑土
JS-62
JS-39
JS-89
冶金锰2#
JS-27
放电锰（MnO2）3#
JS-87
3、结语
本论文以云南建水锰矿（包括矿区土壤）与紫陶土壤为样品，以平板分离法对17个样品进行微生物分离，纯化，总共分到90株耐酸菌，其中真菌75株，放线菌15株。
将分到的菌株发酵,提取浸膏。
再经固相萃取及TLC排重，留下54株。
对选择的菌株以小鼠白血病P388细胞及SRB法进行细胞活性测试。
得到15株细胞毒活性菌株。
其中真菌8株，放线菌7株。
4、综述
4.1.极端微生物
4.1.1研究概况
现在，在许多以前被认为是生命禁区的极端恶劣环境（地球上最寒冷、最炎热以及最不适宜生活的地方），也发现有数以十亿计的生命体，这一些生命体被称为极端微生物（Extremophiles）。
极端微生物（Extremophiles），是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生命形式，与普通微生物相比，它们不仅生活环境奇特，而且具有独特的分子组成、物理化学性能、酶特性及代谢功能，其存在的原理与意义为人们更好地认知生命现象及本质，发展生物技术，揭示生命起源和进化规律提供了宝贵的知识源泉，对阐明生物多样性的形成和演变机制，认识生命与环境的相互作用，不断深化和更新对自然界的认识有重大意义。
目前极端微生物主要研究内容[16]包括：
（1）新物种的发现；
（2）新产物的研究与生产；
（3）极端酶的结构与功能及其基因的克隆表达；
（4）适应机理的分子基础及遗传原理；
（5）基因组分析。
所谓极端环境，是指高温、低温、高pH、低pH、高盐度、高压等普通微生物所不能生存的环境。
已发现的极端微生物有嗜热菌、嗜冷菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜盐菌、嗜压菌等。
在天然的极端环境下生存的独特的微生物,有很高的利用价值。
尽管,到目前为止,国内外这方面的研究已相当多,但仍有很多类群和机理未弄清楚，应用领域也有待于探索。
相信随着科学手段的不断提高,开发和应用极端环境的微生物将会出现诱人的前景。
4.1.2分类及特点
极端嗜热菌（Thermophiles）嗜热菌一般指在55℃以上的高温环境中生长、繁殖的细菌。
菌种不同,其生长温度的上限也不同,有的可达90℃以上。
在海底火山喷口及其周围区域,温泉工厂高温废水排放区常可发现不同菌种的嗜热菌。
如德国的斯梯特（K,Stetter）研究组,在意大利的海底火山喷口发现一族古细菌,能生活在110℃以上高温中,最适温度为98℃,降至84℃即停止生长,斯坦福大学科学家发现的一种嗜热菌,最适生长温度为100℃,80℃以下即失活。
极端嗜冷菌（Psychophiles）在地球极地冰海环境中存在许多独特的微生物分类群。
如异养产气泡的细菌（Octadecabacter）只在冰海和靠近冰海的环境存在。
而PolaromonasVacuolata最适生长温度为4℃,高于10℃则不能生长。
极端嗜酸菌（Acidophiles）这种微生物能生活在pH1以下的环境。
它们往往生长在火山区域含硫量极为丰富的地区。
如氧化硫杆菌,可以在pH0.9—4范围内生长,最适pH=2.5左右;
德国斯梯特就发现一族生活在96℃以上高温,pH值低于1的环境中生物,它们被命名为AcidianusInfernus。
嗜酸菌体内环境保持pH值7左右。
嗜酸菌往往也是嗜高温菌。
极端嗜盐菌（Extremehalophiles）人们发现在高浓度盐环境中,存在许多抗高渗压的微生物。
我国从新疆和内蒙古的盐碱湖中分离出了一些极端耐盐菌。
它们竟能在含0—15%NaCl的环境中生长。
有些菌株可以在含5%—25%NaCl范围中生长。
极端嗜盐微生物中唯一的真细菌是光合微生物的外硫红螺菌属;
唯一的真核嗜盐微生物是杜氏藻类。
微生物学家琼纳斯克（H,Jannasch）在含盐量高达36%盐液中发现一种微生物,命名为Halophiles;
微生物学家斯多肯尼亚斯（W,Stoeckenius）在嗜盐中发现了一种呈四方形的古细菌。
繁殖时,先向一方延长,然后分裂成两个四方形菌;
再一起向另一方延长,进而分裂成四个。
极端嗜碱菌（Alkaliphiles）嗜碱菌往往是嗜盐菌,多生活在盐碱湖和盐池中,生活环境pH值可达11.5以上,最适pH值8—10,但在中性环境如pH值6.5以下,不能生长或生长非常缓慢。
北京微生物研究所的徐毅分离到Natronorubrumgennov的两个种。
我国科学工作者从内蒙古碱湖中分离出一株嗜碱菌No.10—1,其生长pH值为8—13,最适pH值为10—11。
好气,杆状,能运动。
极端嗜压菌（Barophiles）一般生活在最深的海底。
美国海洋学家亚扬诺斯（A,Yayanos）发现一些耐压种,适于在0.7—0.8MPa的环境生长,低于0.4—0.5MPa则不能生长。
有的竟能在1.3—1.4MPa环境生长。
日本科学家也在300—600米深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。
4.1.3极端微生物的应用
极端嗜热菌 ①利用菌体产生的酶,进行废物处理降解纤维素。
②用菌体发酵生产乙醇。
③利用其产物在高温下生产生物表面活性剂。
极端嗜酸菌 用于冶金提取矿物;
用于煤和石油脱硫处理含硫废气;
生产肥料,改良土壤。
如可利用氧化硫硫杆菌分解磷矿粉,提高磷矿粉的速效性,以便提高农作物的产量。
极端嗜盐菌 ①用于生产食用蛋白、食品添加剂,酶的保护剂和稳定剂;
除去工业废水中的磷酸盐,开发盐碱盐,开发能源。
②在基因工程中,大肠杆菌产生嗜盐性芽孢杆菌的胞外木聚糖酶已获成功。
极端嗜碱菌 ①用作洗涤剂的添加剂,粘度调节剂。
②用于基因工程。
已有人将嗜碱菌的纤维素酶,木聚糖木酶、淀粉酶、环状糊精葡萄糖转移酶等在中性菌中加以克隆和表达。
极端嗜压菌 其应用方面报道较少,只在高压生物反应器和基因工程研究中有所应用[1]。
4.2.酸性环境微生物
4.2.1概述
自然界大多数环境的pH值为5—9，它适合多数微生物生长。
酸性环境微生物是一种能在低pH条件下生长和繁殖的极端环境微生物，包括嗜酸菌和耐酸菌。
嗜酸菌通常在pH2—5生长很好，pH5.5以上生长不好[1,7,9,13]。
一般来说，将最适生长pH<
3的微生物称为嗜酸微生物，且种类丰富，在三域生命中均有嗜酸类群，在某些酸性环境中真核生物比原核生物具有更高的多样性[7]。
极端嗜酸菌（Acidophiles）能生活在pH值1以下的环境，有些甚至可以生活在pH低于0的环境中。
而耐酸菌在中性环境也可以生长。
酸性环境微生物广泛的分布在酸性矿山废水、生物沥滤堆以及含硫温泉和土壤，火山区域含硫量极为丰富的地区[10]。
4.2.2酸性环境微生物的分类和主要特征
根据不同分类的标准可将酸性环境微生物分为不同的类群。
以最适生长温度为标准，可分为中温菌、中度嗜热菌和极度嗜热菌；
若以碳源为标准，则可分为化能自养菌和化能异养菌。
4.2.3酸性环境微生物在自然界的行为及酸性环境的产生
此类微生物存在于酸性环境中，而自然界的酸性环境又主要是由酸性环境微生物氧化元素硫或者金属硫化物产生的。
元素硫主要存在于地热区域，由高浓度的二氧化硫和硫化氢反应形成：
SO2+2H2S=2H2O+3S。
自养嗜酸菌和异养嗜酸菌均可以氧化硫形成硫酸。
这时如果没有碳酸盐和其他岩石矿物中和，就会形成大范围的酸性环境。
但自然界的决大多数的酸性环境还是酸性环境微生物氧化硫化矿物形成的。
有些硫化矿是酸溶性的，比如说闪锌矿：
有些矿物是酸不溶性的，比如黄铁矿和砷黄铁矿。
所以，酸性环境微生物利用两种不同生物氧化机制分解它们。
酸溶性的矿物很容易被酸性环境微生物分解，它们可以被酸溶解，形成金属离子和硫化氢。
硫化氢接着被嗜酸菌氧化形成硫酸。
酸溶性的矿石还可以被Fe3+氧化，形成Fe2+和多硫化物；
后者继续被Fe3+成元素硫，接着被氧化成硫酸，所形成的硫酸又可溶解硫化矿物。
4.2.4酸性环境微生物的适应机制
有关酸性环境微生物细胞内维持中性、适应外酸性环境机制的解释主要有三种。
其一，“泵说”，就是米切尔（Mitchell）化学渗透说，认为膜内质子通过呼吸链“泵”到膜外，膜运载蛋白与H+结合，利用质子动力将结合的基质运送到细胞内，从而使膜内保持一定H+浓度；
其二，屏蔽说（barrier），认为细胞质膜是两种环境的渗透屏蔽物。
使外部H+或OH-都不能进人细胞内；
其三，道南（Donnan）平衡说，认为细胞质膜存在高分子电解质，产生的大离子不能透过膜。
所构成的道南电位使小离子向膜两侧扩散达到平衡．致使膜外过量的H+不能进人膜内，致使膜内维持中性状态[9]。
酸性环境微生物生长在酸性环境中，细胞膜是它惟一可以抵御外界H+的物理屏障。
所以，细胞膜对H+的低渗透性可能是它保持细胞内部pH的主要途径。
近几年的研究表明，细胞膜上的脂类物质在这方面发挥着重要的作用。
Vossenberg等研究Picrophilusoshimae时发现，提取自这种酸性环境微生物细胞膜上的脂质体在pH7.0时不能形成有规则的囊泡结构，而在pH3.0和4.0时则可以则的囊泡结构，而在pH3.0和4.0时则可以形成这种有规则的结构，而且这种结构对H+的渗透性极低。
但是，这种结构的脂质体在pH7.0时又会变得有漏洞。
因此，酸性环境微生物不但很好地适应了酸性环境，而且还需要酸性环境来保证其细胞膜的稳定性和细胞的完整性[16]。
4.2.5酸性环境微生物的耐重金属机制
酸性环境微生物之所以能耐受如此高的重金属浓度，是因为体内存在一系列的抗重金属机制[16]。
主要有5种机制在发挥着作用：
①将有毒金属排出细胞，例如通过ArsB蛋白将As3+排出细
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