大肠菌检测-科立得酶底物法介绍.ppt

大肠菌检测-科立得酶底物法介绍.ppt

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水中大肠菌群及大肠埃希氏菌检测科立得酶底物法介绍,IDEXXLaboratories美国爱德士生物科技,背景信息大肠杆菌,大肠菌群（totalColiforms）大肠菌群系指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。

耐热大肠菌群（粪大肠菌群，FecalColiforms）用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。

是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。

大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.）大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。

大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。

相关背景信息大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌,耐热大肠菌群,大肠埃希氏菌,大肠菌群,背景材料检测方法,多管发酵法（multipletubefermentation,MTF）滤膜法（membranefiltration,MF）酶底物法（MinimumMediaONPG-MUG，简称MMO-MUG法，或Definedsubstratetechnology，简称DST）,背景材料检测方法,多管发酵法（MTF）以100mL水样中大肠菌最可能数（mostprobablenumber,MPN）表示培养基制备试管培养（2226小时）阴性结果（无产酸，产气）产酸，产气平板培养1824小时观察菌落形态，挑取特征菌落革兰氏染色，镜检证实试验（361培养箱中培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在,背景材料检测方法,滤膜法（membranefiltration,MF）用孔径为0.45的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数,计数单位为菌落形成单位CFU（colonyformingunit）储备培养基的制备过滤（需器械灭菌等）培养（22-24H）阴性结果（无典型菌落）观察菌落形态,挑取特征菌落革兰氏染色，镜检证实试验（361培养箱中培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在,背景材料检测方法,酶底物法,原理：

1，大肠菌群细菌能特异性产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），该生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside，-半乳糖醛苷），使培养液呈黄色。

2，大肠埃希氏菌能特异性产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase），分解MUG（4-甲基-伞形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）,使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光。

利用该原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。

试剂中同时含有ONPG和MUG，所以本方法可同时检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌，51孔法并可以定量。

检测方法酶底物法（EnzymeSubstrateTechnique）,国标GB/T5750.122006采用:

DST技术酶底物法1,方法采用固定底物技术（DefinedSubstrateTechnology，DST）之酶底物法，DST技术的原理就是采用和目标细菌特异性反应的培养基,并使之量最小化,比一般酶底物法假阳性/阴性的发生率更底。

2，培养基：

采用MinimalMediumONPG-MUG（MMO-MUG），即最少化ONPG-MUG培养基每1000mLMMO-MUG培养基所含基本成份为：

A硫酸铵（NH4）2SO45.0gB硫酸锰Mn（SO4）20.5mgC硫酸锌ZnSO40.5mgD硫酸镁MgSO4100mgE氯化钠NaCl10gF氯化钙CaCl250mgG亚硫酸钠Na2SO340mgH两性霉素BAmphotericinB1mgIOrtho-nitrophenyl-D-galactopyranoside（ONPG）500mgJ4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide（MUG）75mgKSolanium萃取物500mgLN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid钠盐5.3gMN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid6.9g,ONPG的阳性反应（总大肠菌群TotalColiform之阳性反应）（ColilertandColilert-18）,MUG的阳性反应（大肠杆菌E.Coli阳性反应）（Colilert,Colilert-18,Colisure）,Colilert唯一的酶底物法（MMO-MUG）商品化产品,1987年上市，第一次收录在StandardMethods的第18版9223部分,从19-21版都收录在内。

世界卫生组织,饮用水水质指南第三版,2004.第11.6.2部分1989年首次通过美国EPA认证在美国饮用水市场,使用率大约90%至今,七大洲都用此测试方式目前唯一的酶底物法商品化产品（MMO-MUG,DST）,Colilert之应用,饮用水源水瓶装水再生水,废水食品水畜牧用水医疗用水,收录于“标准测试法”内APHA（美国公共卫生协会）,USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO,Colilert实验及调查数据,全世界有许多Colilert之相关资料:

CenterForDiseaseControl美国疾控中心USEPAInformationCollectionRule美国EPA资料收集法则（ICR）UKDrinkingWaterInspectorate英国饮用水监测（DWI）FrancesInstitutePasteur法国巴斯德学会拥有多项全球性的认证/专利IDEXX执照许可,Colilert（酶底物法;MMO-MUG;DST）介绍,一个样品同时检测大肠菌群及大肠埃希氏菌24小时判断结果定性法或定量法（51孔定量盘）根据DefinedSubstrateTechnology（DST）测量技术,Colilert（MMO-MUG,DST）,针对目标细菌（Coliforms&E.Coli）的特异性营养指示剂（培养基）营养指示剂作用时,颜色会改变或呈现萤光反应其它非目标细菌不会干扰,减少杂菌干扰无培养基干扰（传统方式常会因消毒剂、盐、抗生素、毒素、温度造成抑制反应）减少假阳性反应减少假阴性反应不须确认特异性-大肠菌群和大肠埃希氏菌测试结果快速判读容易,优点,*Jacobsetal,AEM,1986.*Frickeretal,WaterRes.,1997,假阳性比较表,假阴性比较表,成本比较表,测试时间比较表,定性检测操作示范,加入Colilert试剂，摇晃至溶解,36培养24小时，判断结果:

1,无颜色变化阴性2,黄色大肠杆菌群阳性3,黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性44.5培养24小时，判断结果：

1,无颜色变化阴性2,黄色粪大肠阳性,51孔法定量检测操作示范,加入Colilert试剂后，摇晃至溶解,将Colilert溶液倒入51孔定量盘Quanti-Tray内,Quanti-Tray定量盘操作示范,将定量盘Quanti-Tray放入程控定量封口机Sealer封口,36培养24小时后，计算呈阳性反应的格子，然后对照MPN表计数（44.5培养24小时用于检测粪大肠）,Colilert使用方式,为了减少培养箱的负荷，所有样品必须回温至室温后使用测试包打开后直接倒入，请勿敲打对照样品请储存于阴暗处请使用运送时刻表以避免对照样品过期测试物呈阴性反应时，Colilert会变成微黄色,Colilert安全方法,将测试包往下压至容器内以避免粉末飞出为避免UV灯直射眼睛，请用UV灯专用护目镜或UV护目箱请依地方法规处理废弃物,Quanti-Tray定量盘方法,从定量盘的标识处打开请把未用完之定量盘留置包装袋内若要开启定量盘，请在定量盘的最上方压制“U”型在将样品倒入。

请注意：

封口盘的塑料是不易碎的，但背面的铝箔封是易碎的。

用笔在定量盘背面作标识勿触碰定量盘里面在细菌培养器堆起定量盘，但勿装入箱中计算所有阳性格子免费提供Quanti-Tray/2000软件,Quanti-Tray废弃物处理方式,请遵守地方法规阴性反应盘可依一般废弃物丢弃阳性反应盘丢弃前应以高温高压灭菌方式（Autoclave）或混合清水的家用漂白剂处理,Quanti-Tray程控定量封口机安全须知,为避免伤害，请勿把手、头发或衣物.靠近封口机封口为避免伤害，请熟练退格键功能请用3叉式插头维修或清理时，请关闭电源,程控定量封口机维护,清理多余溢出的液体插入的橡胶圈可用漂白剂、酒精清洁或以高温高压处理封口机是铝合金及不锈钢制成，因此可用清水、酒精及漂白剂清洗,传统用法的步骤vs.Colilert,IDEXX于1984年成立于美国缅因州，年营业额为7亿美元,在美国纳斯达克上市全球有超过3，000名员工,400多种的产品行销于70以上个国家IDEXX有庞大的研发团队并有40-50位具有专业执照的博士致力于简易、快速、精准具经济效益之测试产品研发检测及诊断试剂和相关设备的全球市场领导者水质食品宠物及经济动物,爱德士公司（IDEXX）简介,爱德士水质检测试剂,全球超过6,500家客户,分散于世界各地超过60多个国家每年15-20%成长率Colilert有全球有超过20个以上的国家（地区）认证:

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大肠菌群，大肠埃希氏菌，18及24小时两种Colisure:

大肠菌群，大肠埃希氏杆菌，24小时Enterolert：

水中肠球菌，24小时Quanti-Tray,Quanti-Tray/2000,Sealer：

独特的定量系统SimPlate：

菌落总数/1ml（HPC）Filta-Max两虫检测系统,爱德士水质检测产品线,谢谢,